图1-2 细菌菌落特征
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实验二 细菌的简单染色
目的
1．学习微生物涂片和染色的基本技术，掌握细菌简单染色法； 2．学习无菌操作，并巩固显微镜的使用方法； 3．学习在油镜下观察细菌的个体形态。
原理
由于细菌体积小、菌体透明，活体细胞内含有大量水分，且对光线的吸收和反射与周围背景没有显著的明暗差，因而很难在普通光学显微镜下观察它们的形态和结构。只有经过染色，借助颜色的反衬作用才可看清菌体形态以及菌体表面结构。染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。
能够使微生物着色的化合物被称为染色剂，染色剂一般都是成盐化合物。目前普遍采用的微生物染色剂多为苯的衍生物，其化学结构中除含有苯环外，还连接有发色团和助色团。发色团可使化合物显色，而助色团则能增加色度，并因具有电离特性，可与菌体细胞相结合，从而使其着色。
含有酸性助色团（如羟基-OH）的染色剂称为酸性染色剂，其电离后分子带负电，可与钠、钾、钙、氨等离子结合，多用于细胞质的染色，如酸性品红、刚果红等。含有碱性助色团（如氨基-NH2）的染色剂称为碱性染色剂，其电离后分子带正电，主要用于细胞核和异染粒等酸性细胞结构的染色。由于细菌细胞质中布满核物质和异染粒等结构，因此细菌染色一般采用碱性染色剂，通常包括氯化物、硫酸盐、醋酸盐或草酸盐等。
细菌的简单染色，即只利用一种染色剂使菌体着色。此法操作简单，适用于细菌形态的观察。通常细菌的简单染色也采用碱性染色剂，如结晶紫或碱性品红等，碱性染料不是碱而是一种盐，电离时染料离子通常带正电荷。而在中性、碱性或弱酸性的溶液中，细菌细胞通常带有负电荷，这样带正电荷的染料离子就容易与带负电荷的菌体细胞相结合并使其着色。染色后便于观察细菌的形态、大小和排列方式等特征。
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材料
1．菌种：大肠杆菌（Esecherichia coli）
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
2．染料：草酸铵结晶紫染液。
3．其它：载玻片，无菌水，洗瓶，擦镜纸，吸水纸，二甲苯或无水乙醚：无水乙醇（3：1）混合液，香柏油及接种用具。
方法
一、细菌的简单染色
1．涂片：在洁净的载玻片中央滴1小滴无菌水，用无菌接种环（火焰灭菌）挑取少量大肠杆菌或金黄色葡萄球菌分别与无菌水充分混合，涂成极薄的菌膜；（注意：菌量不宜过多，否则菌体堆积成块不易看清个体形态！）
2．固定：手执玻片一端，将有菌膜的一面朝上，通过微火3-4次，使水分蒸干；（注意：可用手背接触涂片反面，以不烫手为宜。否则过分烘烤会导致菌体变形！）
3．染色：将玻片置于玻片架上，待其冷却后，在涂片部位滴加适量（盖满菌膜）的草酸铵结晶紫染液，染色1分钟；
4．水洗：倾去染液，用普通蒸馏水自玻片一端轻轻冲洗，至流下的水中无染液的颜色为止。 5．干燥：用吸水纸吸去多余水分；（注意：勿擦去菌体！）
6．镜检：在低倍镜下找到视野后，转换油镜观察，绘制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌形态图； 7．清理：实验完毕后，清洁油镜头，整理显微镜使其复原并在记录本上登记。将染色片放入含有5%苯酚的废片缸中。
二、油镜的使用和清理 1．油镜的使用：
（1）在低倍镜下找到镜检部位后，用粗螺旋将镜筒提升约2厘米，将油镜转置镜筒正下方；
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（2）在镜检部位滴上1滴香柏油；
（3）从侧面注视，用粗螺旋将镜筒小心降下，使油镜侵入香柏油中，让镜头几乎与标本相
接；（注意：不要用力过猛以免压碎玻片损坏镜头！）
（4）从目镜观察，调节光线使其明亮，再调节细螺旋使镜筒缓慢提升，直至视野内出现清
晰物象为止。 2．油镜的清理：
观察完毕，提升镜筒。先用擦镜纸拭去镜头上的油，接着用另一张擦镜纸蘸少许二甲苯擦去镜头上残留的油迹，最后用干净擦镜纸再擦拭两遍以除去残留的二甲苯。涂片处香柏油的处理与此相同。（注意：不要过量使用二甲苯，以免其残留在镜头上影响观察！）
结果
分别绘出油镜下大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态图，注明放大倍数，并描述它们的排列方式。
问题
1．制片时为什么要固定？固定时应注意什么事项？
2．在使用低倍镜、高倍镜和油镜进行观察时应如何调节光线？ 3．你在染色过程中遇到什么问题？应如何避免？ 4．在使用和清理油镜过程中应注意哪些问题？
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实验三 细菌的革兰氏染色
目的
了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。
原理
细菌的革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的。该方法可将所有细菌区分为革兰氏阳性（G＋）和革兰氏阴性（G－）两大类，是细菌学上比较重要和广泛应用的鉴别染色法。
该方法的基本步骤为：先用结晶紫（初染剂）进行简单染色，再用碘液（媒染剂）媒染，碘液能与结晶紫结合形成结晶紫-碘的复合物，从而增强了染色剂与细胞的结合力， 随后用95%乙醇脱色，最后用番红（复染剂）进行复染。。
细菌的细胞壁成分和结构不同，因而对革兰氏染色产生的反应不同。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网格状结构组成，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而使网状结构的孔径缩小，细胞通透性降低，结果使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此呈现蓝紫色；相反，革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，因而导致细胞壁通透性增加，并使结晶紫-碘复合物容易被乙醇脱色，最后被染上复染液番红的颜色，因此呈现红色。革兰氏染色结果不仅与酒精脱色程度有关，同时也与菌龄密切相关，通常用处于对数生长期的菌体进行染色为宜。若菌龄过老，可导致革兰氏阳性菌被染成阴性。
材料
1．菌种：大肠杆菌（Esecherichia coli），37℃ 培养12~16小时
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），37℃ 培养16~18小时 2．染料：草酸铵结晶紫染液，卢哥氏碘液，95%酒精，番红染液
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