材料
1．菌种：紫色直丝链霉菌（Streptomyces violaoeorectus） 灰红紫类群
黑化链霉菌（Streptomyces nigrificans） 灰褐类群 天蓝链霉菌（Streptomyces coelicolor） 蓝色类群 丰加链霉菌（Streptomyces toyocaensis） 白孢类群
2．染色剂：石炭酸复红染液或草酸铵结晶紫染液 3．培养基：高氏一号培养基
4．灭菌物品：玻璃纸，盖玻片，1ml吸管，培养皿，镊子，玻棒，玻璃刮铲，15×150mm试管分装9ml无菌水。
5．其它：剪刀，载玻片，无菌水，洗瓶，擦镜纸，吸水纸，二甲苯，香柏油及接种用具。
方法
1．玻璃纸培养法
（1）玻璃纸灭菌：将玻璃纸和滤纸剪成培养皿大小的圆纸片，用水浸泡后交互重叠放在培
养皿中，湿热灭菌后备用；
（2）制备平板：将已融化的高氏一号培养基（冷却至45℃左右）倒入无菌培养皿，每皿
约15-20ml，凝固后备用；
（3）铺玻璃纸：用无菌镊子将无菌玻璃纸平铺于培养基表面，若其间有气泡可用无菌玻璃
棒将气泡除去；
（4）制备孢子悬液：向放线菌培养物斜面加入5ml无菌水，用无菌接种环刮下斜面孢子，
混匀备用；
（5）接种：用无菌吸管向玻璃纸表面加入0.1ml孢子悬液，然后用无菌刮铲涂匀，置28℃
培养一周后观察；
（6）制片：在洁净载玻片上滴1小滴无菌水，并稍涂布。用无菌镊子小心取出玻璃纸，再
用无菌剪刀剪下1小块，菌面朝上平贴于水滴上；（注意：其间不能有气泡！）
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（7）观察：将载玻片直接置于显微镜下观察。
2．插片法
（1）制备平板：方法同前。培养基厚度可达培养皿高度的一半；
（2）接种：用接种环从放线菌试管斜面上挑取孢子，在培养基与盖玻片之间做“之”字型
密集划线；
（3）插片：用无菌镊子取无菌盖玻片，以45°角斜插入培养基（插入深度约占盖玻片一
半长度）；
（4）培养：将培养基平板倒置于28℃培养箱中，培养7天；
（5）镜检：用镊子小心取出盖玻片，稍微加热固定，再用石炭酸复红染液染色1分钟，然
后置于载玻片上，用油镜进行观察。（注意：固定时应避免过火加热导致菌丝体变形，染色清洗时应小心以免冲掉菌丝体！）
结果
绘制各放线菌的孢子丝形态图并列表比较说明其菌体形态和菌落特征。
表7-1 放线菌的形态观察
菌名 紫色直丝链霉菌 黑化链霉菌 天兰链霉菌 丰加链霉菌
菌体形态
菌落特征
问题
1．插片法用于观察放线菌各有何优点？ 2．培养放线菌的培养基有何特点？
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实验八 酵母菌形态及细胞结构的观察
目的
1．观察酵母菌的出芽生殖方式；
2．观察酵母菌的细胞形态、主要细胞器及假菌丝形态； 3．学习并掌握区分酵母菌死活细胞的染色方法； 4．观察酵母菌的子囊及子囊孢子形态。
原理
酵母菌分属于子囊菌门和担子菌门，一些菌株未发现有性生殖。酵母通常是多形态、不运动的单细胞微生物，很多酵母细胞在一定条件下，芽殖后不脱落而形成假菌丝。它们的菌落形态类似于细菌，但体积较大。其细胞内部结构清晰，可通过不同的染色方法在高倍镜下进行区分，如中性红是液泡的活体染色剂，可将其染成红色；脂肪滴可被苏丹黑氧化而呈蓝黑色；肝糖粒可被碘液氧化呈深红褐色。无性生殖有芽殖和裂殖两种，芽殖又有单出、双出和多出之分。酵母菌的有性生殖一般能形成4~8个子囊孢子。
酵母菌的死活细胞可通过美兰染色加以区分。美兰（又称亚甲基蓝）是一种无毒性染色剂，其氧化型为蓝色，还原型为无色。由于活细胞具有较强的还原能力，可使美兰由蓝色的氧化型转变为无色的还原型。处于代谢旺盛的细胞还原美兰染料的能力强，细胞为无色，而代谢缓慢的老细胞和死细胞为浅蓝色或深蓝色。
材料
1．菌种：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
热带假丝酵母（Candida tropicalis）
2．染料：0.1%美兰染液，0.1%中性红染液，0.5%苏丹黑染液，二甲苯，0.5%番红水溶液，碘液、0.5%孔雀绿染液，95%乙醇溶液。
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3．培养基：葡萄糖醋酸盐培养基，马铃薯葡萄糖培养基（PDA）。
4．其它：无菌盖玻片，无菌镊子，载玻片，盖玻片，无菌水，洗瓶，擦镜纸，吸水纸及接种用具。
方法
1．芽殖观察
（1）制片：取一洁净载玻片，在其中央滴1滴美兰染色液，用接种环分别取少许酿酒酵母
菌苔在染液中涂匀。再用镊子取一盖玻片，以45°角与菌悬液接触后，轻轻盖在菌悬液上，避免产生气泡，然后用吸水纸吸干多余液体；
（2）观察：将水压片置于高倍镜下观察。观察芽殖和死、活细胞的颜色。30分钟后，再
次观察死、活细胞数是否发生了变化。 2．假菌丝的观察
（1）培养：将热带假丝酵母划线接种于马铃薯葡萄糖培养基平板表面（注意倒平板不要太
厚），26℃~28℃培养1~2天，取出培养物，在无菌条件下，将一事先灭菌的无菌盖玻片轻轻压在划线处，继续培养1~2天； （2）观察：打开培养皿盖，于高倍镜下直接观察。 3．酿酒酵母细胞内结构的观察
（1）液泡：在洁净载玻片中央滴1滴0.1%中性红染液，用接种环挑取少许酿酒酵母菌苔
涂于染液中，加盖盖玻片后制成水压片，染色4-5分钟，高倍镜下观察液泡在细胞中的颜色、位置、大小和数目；
（2）脂肪滴：首先将酿酒酵母涂片、自然干燥固定，然后用0.5%苏丹黑染液染色10分钟，
倾去染液并用吸水纸吸干。接着用二甲苯冲洗涂片至洗脱液无色后，再用0.5%番红染液复染1-2分钟。水洗吸干后，在高倍镜下观察脂肪滴的颜色、位置、大小和数目； （3）肝糖粒：制一碘液水压片，染色1分钟后，高倍镜下观察肝糖粒的颜色、形状、大小
和数目。
（4）酿酒酵母菌子囊孢子的观察
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① 培养：将活化培养2~3次的酵母菌于28℃温箱中培养2-3天，然后移至葡萄糖醋酸
盐培养基斜面上，于26℃~28℃温箱中培养10天；
② 染色：从产孢培养基上挑取少许菌苔于载玻片上，涂片、加热固定后，先加孔雀绿染
色1分钟，水洗，再用95%乙醇浸润30秒，倾去乙醇，然后用0.5%番红液复染30秒，倾去染液，最后用吸水纸吸干；
③ 镜检：在高倍镜下观察子囊孢子的颜色、数目和形状。
结果
1．绘制酿酒酵母的芽殖方式图。 2．绘制热带假丝酵母的假菌丝图。
3．绘制酿酒酵母子囊及子囊孢子的形态图。
问题
1．如何辨别并确定细菌和酵母菌菌落？ 2．简要说明如何区分营养细胞和子囊孢子。
3．用美兰染液染色30分钟前后酿酒酵母菌死、活细胞数发生怎样变化？为什么？
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