实验六 细菌的鞭毛染色及其运动性观察
目的
1．学习并掌握细菌的鞭毛染色法； 2．学习并掌握悬滴法观察细菌运动。
原理
鞭毛是细菌的运动器官，它着生于细胞膜上。其直径通常为10~20nm，只能用电子显微镜进行观察。只有采用特殊染色方法时，才可在普通光学显微镜下看到。本实验采用银染法，即先利用媒染剂促进银离子在鞭毛上的沉积，加粗其直径，这样就能在显微镜下看到深褐色的菌体及褐色的鞭毛。媒染剂是一种可以和染色剂形成不溶性化合物并能增强染色剂和细胞亲和力的化学物质，它与细胞和染色剂都有很强的结合力，可在染色前使用，也可在加入染色剂的同时使用。按其化学性质可将媒染剂划分为碱性媒染剂和酸性媒染剂两种，前者如矾、硫酸亚铁和酒石酸锑钾等，后者如鞣酸和苦味酸等，本实验使用的媒染剂为鞣酸（也称单宁酸）。
鞭毛是细菌分类鉴定的重要特征之一，如大多数球菌不生鞭毛，杆菌中有些长鞭毛，有些则不长，弧菌和螺菌都具有鞭毛。采用鞭毛染色法虽可观察到鞭毛的形态、着生位置和数目。若只需了解供试菌株是否具有鞭毛，则采用悬滴法较简便。该法可直接在显微镜下通过观察细菌的运动状况，来推断鞭毛是否存在。有鞭毛的细菌在幼龄时具有较强的运动力，而衰老的细菌鞭毛易脱落，因此，观察时应选用幼龄细菌。
材料
1．菌种：普通变形杆菌（Proteus vulgaris）
大肠杆菌（E.coli）
2．染料：鞭毛染液A液，鞭毛染液B液（需现用现配）
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3．其它：干净载玻片，凹玻片，盖玻片，无菌水，装蒸馏水的洗瓶，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，接种用具。
方法
一、菌株准备：将供试菌株在细菌培养基斜面上连续转接三次，每隔12小时一次， 提供
做鞭毛染色的菌株，菌龄应为12~16小时；
二、鞭毛染色：
1．制备菌液：用无菌长滴管取3-5ml无菌水，沿试管壁轻轻加入普通变形杆菌及大肠杆菌斜面上，将该试管置于37℃温箱中静置10min（放置时间不宜太长，否则鞭毛会脱落），使菌株的鞭毛逐渐在水中舒展开；
2．制片：取一经洗液浸泡过的干净玻片，分别滴1滴菌悬液于玻片的一端，然后轻抬此端使菌悬液缓慢流向另一端，并在空气中自然干燥固定；（注意：千万不要用火烤！） 3．染色：
（1）在涂片处滴加鞭毛染液A液染色5min；
（2）用蒸馏水充分洗净A液；（注意：一定要充分洗净A液后再加B液，否则背景很脏，
不易观察！）
（3）用鞭毛染液B液冲去残水，再加B液于涂片处，静置1min； （4）用蒸馏水洗净B液，自然风干； 4．镜检：在油镜下观察鞭毛的形态。
三、悬滴法观察细菌的运动
1．制备菌悬液：用无菌长滴管分别向普通变形杆菌、大肠杆菌斜面滴加5ml无菌水，制成轻度混浊的菌悬液；
2．涂凡士林：取一干净无油的盖玻片，在其四周涂少许凡士林； 3．滴菌悬液：用无菌长滴管分别向盖玻片中央滴1滴菌悬液；
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4．盖凹玻片：将凹玻片的凹槽对准盖玻片中央的菌悬液，并轻轻盖在盖玻片上，使两者粘在一起，然后反转凹玻片，使菌液恰好悬在凹槽中央；
5．镜检：由于菌体透明，镜检时可适当缩小光圈或降低聚光器，以增大反差，便于观察；可先在低倍镜下找好视野，再转换至油镜下仔细观察。注意区分细菌运动与布朗运动的区别；
6．清理：清理显微镜、废玻片及桌面。
结果
1．油镜下观察普通变形杆菌的鞭毛形态，绘图并描述染色结果。 2．将悬滴法观察结果记录于下表：
表6-1 细菌的鞭毛染色
菌名 普通变形杆菌 大肠杆菌
运动方式
鞭毛着生位置
问题
1．为什么在染色前必须将供试菌株连续传接几代？
2．你在显微镜下看到的鞭毛是否为原来的大小和形状，为什么？
3．在不经固定和染色的情况下观察细菌，应如何调节显微镜？观察细菌运动时，如何区分 细菌的运动、布朗运动和菌液的流动？
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实验七 放线菌的形态观察
目的
1．学习观察放线菌形态的基本方法； 2．观察放线菌的个体形态特征。
原理
放线菌是一类丝状原核微生物，因其菌落在固体表面常呈放射状生长而得名。放线菌主要存在于土壤中，大部分是腐生菌，少数寄生，也有与植物共生固氮的，如弗兰克氏菌属。从土壤中分出的放线菌主要是链霉菌（主要孢子丝的形态特征见图7-1），放线菌中除链霉菌以外的其它种通常被称为稀有放线菌。
放线菌是最主要的抗生素产生菌，且约有70%的抗生素来源于链霉菌，因而其形态特征是菌种选育和分类的重要依据。放线菌通常由分枝发达的菌丝体组成，菌丝直径为0.2~1.2μm。主要由两部分组成，一部分长在培养基内，一般没有横隔，有固定和吸收养分的作用，称为基内菌丝或营养菌丝；当基内菌丝发育到一定阶段，即可向空中伸展形成气生菌丝。有的菌种没有气生菌丝。在显微镜下观察时，气生菌丝颜色较深，并且比基内菌丝粗两倍左右。有些种的气生菌丝发育到一定阶段，其顶端可形成孢子丝。有的仅在气丝上形成单个或一对球形孢子。孢子丝分直、波曲、螺旋等形状。螺旋有松、紧、大、小之分，其方向也有左旋和右旋之分，大多数种为左旋 ，少数种则为右旋。螺旋的数目也是种的特征之一。孢子丝的着生方式分为单生、丛生和轮生。轮生是指由一点出发长出三个以上孢子丝的着生方式。大部分放线菌的孢子丝长到一定阶段均可凝聚分裂形成孢子，如链霉菌；少数则以较原始的横隔分裂方式形成孢子，如诺卡氏菌。孢子有球状、椭圆状、杆状、瓜子状等形状，在光镜下即可观察。
放线菌菌落小，与培养基结合较紧密，不易用接种钩挑取，因而难以直接观察。玻璃纸培养法适合直接观察放线菌自然生长的个体形态。玻璃纸具有半透膜特性，若将放线菌
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培养在玻璃纸培养基表面，它可通过玻璃纸吸收培养基中的养分并形成菌落或菌苔，将玻璃纸剪下平贴于载玻片上即可直接观察。插片法适合进行营养菌丝、气生菌丝和孢子丝的比较观察。在接种放线菌的培养基一侧，以45°角插入无菌盖玻片，使放线菌沿培养基与盖玻片交界处生长，并附着于盖玻片上，待菌丝生长一定时间后， 取下盖玻片进行染色，即可直接观察。
图7-1 链霉菌的孢子形态
1．直丝； 2. 弯曲； 3. 簇生； 4. 单轮生，无螺旋； 5. 开环，简单螺旋形钩状； 6．松螺旋； 7.紧螺旋； 8.具螺旋单轮生； 9. 无螺旋二轮生； 10.具螺旋二轮生
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