基因克隆
1. 查找目标基因的基本信息，查找相关文献，设计克隆基因方案。利用DNA处理软件和引物设计软件设计引物，将引物序列送公司合成，根据合成引物的退火温度确定PCR退火温度。
2. 查询该基因有表达的细胞株，培养细胞，采用Trizol法提取总RNA。 3. 反转录。
4. PCR：首先进行预实验，跑胶初步判断大小，摸索最佳退火温度和体系。然后进行回收目标片段。
5. 连接18T vector：载体和插入片段的比例为1:3。 6. 转化感受态细胞，筛选单克隆。
7. 挑取单克隆至1ml LB液体培养基（含抗生素）中，37℃，300rpm，约10~12 h，小抽并且进行酶切验证。
8. 测序：挑取酶切验证正确的阳性克隆送测序。
9. 根据测序结果，将测序正确的片段连接入真核表达载体。实验室有多种表达载体，根据需要选择。连接体系参考T4Ligase 说明书。
10. 连接产物转化感受态，挑选阳性克隆进一步酶切验证，挑取阳性克隆中抽质粒并纯化，瞬转真核细胞（根据课题的方向选择细胞株），Western Blot验证所构建的表达载体是否在该细胞株中表达。 11. 大抽，操作步骤详见说明书。
中抽质粒（基因克隆时酶切验证时所用方法）
1）6000 rpm，离心5 min（4℃），弃上清;
2）重复步骤1），收集3~4ml菌液至1个EP管中；
3）加入2.5 ml 预冷的solution Ⅰ，吹打混匀，充分悬浮细菌； 4）加入2.5 ml 现配的solution Ⅱ，轻柔颠倒几次，充分混匀 （solution Ⅱ配置：0.4 M NaOH：2% SDS=1：1）；
5）加入3.5 ml预冷的solution Ⅲ，轻柔颠倒几次，充分混匀，中和裂解液的碱性；
6）冰浴10 min，使杂质充分沉淀；
7）12,000 rpm 离心10 min（4℃），轻轻吸取上清800 μl/管，转移至干净的1.5 ml离心管中；
8）加入2/3 体积的异丙醇（530 μl），混匀后冰浴5 min； 9） 12,000 rpm离心10 min，弃上清；
10）预冷的70% 乙醇溶液 750μl/管洗涤DNA沉淀，12,000 rpm离心10 min（4℃）；
11）弃上清，晾干，每管加入30 μl TE(含20μlg/ml RNase)，65 ℃，5 min；去除RNA；
12）将几管合并至一管，加等体积酚、氯仿混合液(成品)，剧烈振荡10 s； 13） 12,000 rpm离心10 min，取上清；
14）加入1/10体积的3 M NaAc 和2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，即1ml； 15）12,000 rpm 离心10 min，弃上清；
16）70% 乙醇水溶液洗涤DNA沉淀，12,000 rpm离心10 min，弃上清； 17）用适量ddH2O或者TE溶解DNA沉淀，得比较纯净的DNA，测浓度。
琼脂糖凝胶电泳
1) 2)
配制足量的电泳缓冲液（1xTAE 或0.5xTBE）用以灌满电泳槽或配制凝胶； 根据欲分离DNA片段的大小用电泳缓冲液配适宜浓度的琼脂糖溶液：准确称量琼脂糖干粉加到盛好电泳缓冲液的玻璃瓶中； 3) 4)
玻璃瓶松松盖住，沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖溶化；
用隔离手套转移玻璃瓶到55℃箱内后，待溶化的凝胶稍冷却后加入EB，终浓度为0.5 ug/ml,轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液； 5)
琼脂糖冷却时，用一合适的梳子形成加样孔，梳齿的位置应在托盘底面上0.5-1.0 mm,这样琼脂糖浇灌到托盘时将形成符合要求的加样孔； 6) 7) 8) 9)
浇灌温热的琼脂糖溶液进入模具；
让胶完全凝结，室温下30-45min,小心拔出梳子，将凝胶安放到电泳槽中； 向电泳槽中加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶1 mm；
混合DNA样品和0.2倍体积的6xloading buffer,用微量移液器将样品混合液缓慢加至加样孔中；
10) 1关上电泳槽盖子，接好电极插头，设好电压和时间，按Run键，DNA应
向阳极移动；
11) 当DNA样品或染料在凝胶中迁移了足够距离时，关上电源、拔下插头和打
开电泳槽盖，取出胶放入凝胶成像仪中拍照。
RT-PCR
1)
根据所测的RNA的浓度，计算上样500 ng的RNA样品所需的体积，用DEPC 水补至5 ul，加入1 ul的6xloading buffer进行电泳：120V、15 min。
2) 根据所测的RNA的浓度，计算上样2 ug RNA样品所需的体积，用DEPC
水补至5 ul
随机引物 dNTP RNA 1 ul 4 ul 5 ul
65℃ 5min
5 x buffer Inhibitor RTase DEPC水
30℃ 10min 42℃ 50min 70℃ 15min 4℃ forever
4 ul 0.5 ul 1 ul 4.5 ul
PCR产物胶回收
1)
按照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书步骤，制备含大加样孔的1%琼脂糖凝胶电泳，将PCR产物加入加样孔。 2)
电泳结束后，在320nm波长紫外灯下根据Marker指示快速切取目的片段，用纸巾转移至Ep管，秤取其重量。 3)
加入相应体积的溶胶液Buffer DE-A，水浴锅75℃加热至凝胶完全融化（约6-8min）。 4) 5) 6) 7) 8) 9)
加入Buffer DE-B，混合均匀。
将上步骤的所得液体加入DNA制备管中12,000×g离心1min，弃滤液。 加入500ul Buffer W1，12,000×g离心30s，弃滤液。 加700ul Buffer W2，12,000×g离心30s，弃滤液。
以同样的方法再用700ul Buffer W2洗涤一次，12,000×g离心1min。 将制备管置于洁净的1.5ml离心管，在制备膜中央加25-30ul Eluent Buffer，室温静置1min。12,000×g离心1min洗脱DNA。