质粒纯化
1）质粒酶切后加入200 ul ddH2O，然后加入100 ul 酚/氯仿，剧烈震荡混匀； 2) 4℃, 12000 rpm, 15 min；
3)转移上清至一新EP管中，加入1/10体积的3 M NaAC和2倍体积的无水乙醇，充分混匀（直接从大抽质粒纯化时，100 ul质粒（不够，ddH2O补齐）+30 ul 3 M NaAC + 200 ul无水乙醇）； 4) 4℃, 12000 rpm, 10 min；
5)用预冷的75%乙醇洗3次（4℃, 12000 rpm, 5 min每次）；
6)用75%乙醇装满，拿进细胞房，倒掉乙醇，风干5-6 min（不超过10 min，否则难溶）；
7)加入20-40 ul 1xTE buffer（已过滤除菌）充分溶解； 8)测浓度，分装，-20℃保存。
细胞DNA抽提
1) 吸弃去培养液，用PBS洗两次（6孔板中）；
2) 加1 ml细胞裂解液、40 ul 20 mg/ml的蛋白酶K、10ul的10mg/ml的RNaseA，
用封口膜封好，再用保鲜膜包好后，55℃烘箱过夜；
3) 2 ml异丙醇沉淀DNA，摇匀后，用枪将DNA 挑起放入新的1.5 ml EP管中； 4) 75%酒精沉淀两次，12000 rpm，5min，再用100%的酒精洗一次； 5) 晾干后，加入1xTE 100 ul 溶解过夜。
鼠尾中DNA的提取
1) 在含有约0.5 cm 小鼠尾巴的EP管中加入600 ul 50 mM的NaOH； 2) 在金水浴中90-100℃煮1 h；
3) 加入50 ul pH 8.0的Tris/HCl后，颠倒混匀； 4) 12000 rpm，20 min；
5) 取上清500 ul于另一做好标记的管中。
Real-time PCR
1. SYBR检测方法：
（请注意2.5xRealMasterMix和20xSYBR solution避光保存） 1) 20xSYBR solution在室温下平衡并彻底混匀。
2) 将125 ul 20xSYBR solution 加入至1.0 ml 2.5x RealMasterMix中。
（加入20xSYBR solution的2.5xRealMasterMix溶液在-20℃可以保存三个月。在使用前务必彻底混匀RealMasterMix/SYBR solution。如果解冻后并没有使用，一定要注意在再次冷冻前彻底混匀。 反应体系
组成成分 50 ul体系 25 ul体系 11.25 ul 20 ul体系 9 ul 终浓度 1x 2.5xRealMasterMix 22.5 ul /20xSYBR solution 正向引物 反向引物 DNA模板 超纯水
2．PCR检测 反应步骤（建议） 循环 1x 步骤 1 2 35-45x 3 4 至50 ul 至25 ul 至20 ul 100-300nM 100-300nM -ng-pg 温度 94-95℃ 94-95℃ 50-60℃ 68℃ 时间 1-2min 10-20s 10-30s 10-60s 内容 起始模板变性 PCR循环中模板变性 退火 延伸 （解链时间的长短与模板的长度和GC含量有关）
2. 引物稀释：
引物总浓度为1 ?M，体积：200 ?l
ddH2O Primer 1 (20 uM) Primer 2 (20 uM) Total
3. SYBR mixture与template的混合：
SYBR mixture DNA template Total
4. 操作流程：
1）加人10 ul 稀释好的primer至管底
2）加入10 ul SYBR mixture与template的混合物 3）Vortex and Spin down 4）放入仪器检测
5. PCR程序 95℃ 2 min 95℃ 15 s 60℃ 30 s 68℃ 30 s 95℃ 15 s 60℃ 1 min 95℃ 15 s 60℃ 15s **68℃收集荧光
6. 仪器的使用
溶解曲线 40x
40x
9 ul 1 ul 10 ul 180 ul 10 ul 10 ul 200 ul