(1) 建立文件 1）打开7300 software 2）点击Create New document 3）Next 4）Next
5）点击Create New File
6）Add files （e.g. Actin, PDE4DIP）to the right box 7）Next 8）Select wells 9）Finish 10) Name 11) Done (2) 检测
1）打开菜单栏中的Instrument
2）Edit program （将默认program的后两项删除->add step->输入数值->add step…->program输入完成，点击add dissociation stage->下方下拉框中选择Data collection为68℃） 3）Save file至指定文件夹 4）放入样品 5）点击Start
6）程序完成后关闭software和仪器
注意事项：
1）先开仪器，设好program再开始配制试剂 2）使用SYBR mixture一定要先恢复到室温 3）配制试剂尽量避光（超净工作台操作）
4）检测用的PCR管盖不能标记、及用手碰触，带手套操作 5）冰上配制，PCR管先预冷
6）荧光产物很容易污染，不能随便打开盖子，要丢弃指定位置 7）使用无RNA酶的耗材操作
Western blot检测
1) 2)
配制分离胶和浓缩胶；
加样电泳：向凝固好的加样孔中加入等量的蛋白，在电泳槽中进行电泳，采用恒压模式，初始电压为50 V，待样品进入分离胶后电压增至100 V，根据蛋白大小决定电泳时间； 3)
转膜前准备：提前10 min将PVDF膜浸泡在甲醇中，滤膜和海绵浸泡在转膜液中； 4)
转膜：按照以下顺序装配转膜装置：负极→海绵→滤纸→凝胶→PVDF膜→滤纸→海绵→正极，将转膜装置放入电转槽中，将电转槽置于4℃冰箱，40 V恒压12 h (蛋白>250 kDa，50V，16 h)； 5)
封闭：转膜结束后取出PVDF膜，在正面做好标记，将膜置5%脱脂奶粉中室温封闭1-3 h； 6) 7) 8) 9)
一抗孵育：加入稀释好的一抗，室温孵育2-3 h； TBST洗膜 洗3次，15/5/5/5；
二抗孵育：二抗用5%封闭液按1：1000-5000稀释，室温孵育2-3 h； TBST洗膜 洗3次，每次10 min；
10) 曝光显影：将膜蛋白面与荧光混合液充分接触；孵育10 min，使用镊子将
膜轻轻转移到另一保鲜膜上，将残存的底物吸干，包好，放入X-光片夹中固定好，取大小适中的感光片盖在膜上，曝光15 s/1 min/3 min； 11) 定影：将X-光片从光片夹中取出，在显影液中浸泡30s，取出，浸入定影液
中，以胶片透明为止，用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。
显影和定影的具体步骤及注意事项（要点：均匀、快速）: 1) 2) 3) 4) 5) 6)
将底物（Bio-Rad）按1:1混合（1.5 ml + 1.5 ml）；
二抗孵育洗膜后将膜至于面巾纸中，快速轻压一下，取出至于底物混合液中； 将膜快速浸湿其中一面，然后镊子提取翻转，浸湿另一面； 室温避光放置5 min；
将膜取出沾一下面纸以吸走多余底物； 将膜置于保鲜膜上，包好，放置于暗夹中；
7) 8) 9)
暗房中，取出X-光片，抵住暗夹一侧，快速连同暗夹盖子一起合上； 曝光时间结束，将暗夹倒转放置，打开盖子，快速取出X-光片置于显影液中； 均匀充分显影后将X-光片至于定影液中；
10) 定影结束用自来水清洗轻柔漂洗X-光片。
Transfection（Lipofectamine 2000）
1）Seed 8x105 HEK293 cells to 6-well plate and culture overnight;
2) Change medium to pre-warmed Opti-MEM 1 h (or medium with PS 3 h) before transfection;
3) Prepare following solution:
A: 4 ug DNA plasmid + 250 ul Opti-MEM B: 10 ul lipofectamin + 250 ul Opti-MEM Incubate for 5 min at RT;
4) Mix A and B gently, and incubate for 20 min at RT; 5) Add DNA/lipo mixture onto cells;
6) After incubation for 4-6 h, change medium without PS.