感受态细胞的制备
1. 准备LB培养基和LB平板。
2. 取冻存的Ecoli,37 ℃融解后接种于LB平板上，37 ℃培养16-20h。 3. 在平板上挑取单菌落（2-3mm）,转到含有100mlLB培养基的1L的烧瓶中，37 ℃剧烈振荡培养（250-300r/min）3h。
4. 去1.5mlEp管，加入1mlLB培养基，再加入200ul菌液，37 ℃振荡孵育过夜（300rpm/min）。
5. 在无菌的500ml烧瓶中加入50mlLB培养基，加入0.5-1 ml 培养过夜的的菌液（即稀释50-100倍），然后与37 ℃ 300r/min 振荡孵育OD600=0.6(0.4-0.6)(约2h)。
6. 当菌液密度达到0.6以后，将菌液在冰上放30min.。
7. 将菌液在转入50ml离心管，4 ℃ 2500rpm, 离心20min,弃上清。 8. 将沉淀用25ml预冷的0.1M Cacl2 重悬，按步骤7重复一次，弃去Cacl2 溶液。
9. 用2ml 预冷的0.1M Cacl2 重悬沉淀（轻柔），然后在冰上放置1h.。 10.在重悬的菌液中加入丙三醇（甘油）（15% v/v）(即857ul 50%灭菌甘油)，充分混匀后分装，200ul或100ul每管（1.5mlEp管），-80℃保存。
感受态细菌的转化
1) 2) 3) 4) 5) 6)
-80℃中取出已制备好的感受态菌，冰上放约20 min。 去1 ul质粒加入1个感受态管中，混匀，放冰上约30 min。
将混合液放入已加温至42℃的循环水浴中，90 s（其间，不要摇动管子） 快速转到冰浴中，3 min。
加800 ul不含任何抗生素的培养基于每管，37℃，120 r/min，摇1h。 取100 ul菌涂板于含有相应抗生素的LB培养板上，37℃培养箱中倒置平板培养12-14 h，出现菌落。
SDS碱裂解法制备质粒DNA（小抽）
1)
取1 ml LB培养液加入1个1.5ml的EP管中，挑一个单菌落于该管中，37℃，300r/min，摇过夜，800ul用于提取质粒，200ul保留。 2) 3) 4)
6000 rpm，5min，弃上清。
加入250 ul预冷solutionI/管，充分混匀，重悬细菌。
加入新配制的solutionII 250 ul/管，反复颠倒(轻轻5-10次)混匀5次，以混合内溶物，室温静止3-5 min。 5)
加入350 ul/管的solutionIII，快速反复颠(轻轻5-10次)倒混匀后，冰浴10 min。 6) 7) 8) 9)
12000 rpm，5 min，取上清750 ul转移到新的1.5 ml的EP管中。 加入500 ul(2/3)体积的异丙醇，充分混匀后冰浴5min,沉淀DNA。 12000 rpm，10 min，弃上清。
加入预冷的70%乙醇润洗除盐，12000 rpm，3min，弃上清。
10) 加入10 ul含RNase的TE融解DNA，65℃反应10min(37℃反应1 h) 11) 质粒检测。
中抽质粒
1)
取小抽剩下的200 ul菌液转入50ml的含Amp+的LB培养基中，37℃，300rpm,摇约16h。 2) 3) 4)
6000 rpm，5min,弃上清，收集菌体。 加入2.5ml预冷solutionI/管，重悬菌体。
加入新配制的solutionII 2.5ml /管，反复颠倒混匀5次，以混合内溶物，室温静止3-5min。 5) 6) 7) 8) 9)
加入3.5ml /管的solutionIII，快速反复颠倒混匀后，冰浴10min。 12000rpm,10min,取800ul/管上清于新的1.5 ml的EP管中。 加入2/3体积（533.3ul）的异丙醇，充分混匀后室温放5min。 12000rpm，3min，弃上清。
加入预冷的70%乙醇700ul/管，润洗除盐，12000rpm，10 min，弃上清。
10) 质粒DNA晾干透明后，加入300ul/管含RNase的TE融解DNA（65℃反应
5min）
11) 加入等体积300 ul的（苯酚:氯仿=1:1）剧烈震荡10s，然后4℃，12000rpm，
10min。
12) 吸取上清于另一管中，加入1/10体积的3M NaAC,两倍体积的无水乙醇，
混匀后室温放置3min。
13) 4℃，12000rpm，10min，弃上清，加入预冷的70%乙醇润洗除盐。 14) 加入合适体积的含RNase的TE融解DNA（200ul）。 15) 质粒检测