划痕实验
1）用marker笔在6孔板背面用尺子比着划5道横线； 2）铺适量细胞于6孔板中；
3）细胞密度达95%用200 ul进口枪头比着直尺划3道垂直直线（贴壁不牢的细胞可改用10 ul的枪头）；
4）PBS洗3遍以去除漂浮细胞；
5）加入1 ml培养基，拍照（取样点为交叉点的上下位置）；
6）加入含10?S培养基继续培养（FBS的量可根据不同细胞调整）； 7）每12 h或24 h拍照。
Transwell assay
1) Cell cultured to 80-90% confluence; 2) Starve the cells overnight (12 h);
3) Equilibrium the transwell insert with medium without FBS at 37℃ for at least 1 h or overnight;
4) Trpsinize the cells and adjust the density to be 1 x106/ml with medium containing 0.1% BSA and no FBS;
5) Add 100 ul cells (1x105) to transwell insert in medium containing 0.1% BSA and no FBS;
6) Add 600 ul medium containing 10% FBS to lower chamber; 7) Incubate for 24 h; 8) Wash the cells with PBS;
9) Fix the cells with pre-chill methanol (-20℃);
10) Stain the cells with 0.5% crystal violet diluted in 20% methanol for 10 min; 11) Wash the inserts with PBS 3x (Plate the insert in wells containing PBS); 12) Carefully remove the cells on upper site of the membrane with cotton sticks; 13) Count the cells under microscopy.
Note: Medium used in this assay without PS!
裸鼠成瘤实验
实验动物：4-5周龄nu /nu裸鼠购于维通利华；裸鼠长至6-8周龄进行肿瘤接种。
所需细胞量：
5 x 106 x 8只x 2=8 x 107 约8个10 cm plates (2倍的细胞量) 细胞处理： 1) 2) 3) 4)
小心吸去培养基，10 ml PBS洗一次；
每个10 cm 盘加入1.5 ml 0.25%的胰蛋白酶消化，RT 5 min； 用新鲜培养基重悬细胞，转至50 ml离心管，800 rpm离心5 min；
吸去培养基，用30 ml PBS重悬细胞，充分吹成单个细胞(先加4 ml PBS吹散细胞，再加26 ml PBS上下颠倒混匀)； 5) 6)
细胞计数，计数完成后算出细胞总量，800 rpm 离心5 min，
用PBS调整细胞密度为为5×107个/ml，吹打成单细胞悬液，细胞放置于冰上(避免冰中有水，快速低温半小时之内接种于裸鼠体内)； 7)
裸鼠接种： 1)
皮下麻醉注射，酒精棉球消毒皮肤，针头刺入，进针4/5，即可注射，注射完成快速抽出针头，镊子轻镊注射口10 s，以防细胞因压力而溢出； 2)
肿瘤的测量: 1)
接种后每天定时观察与记录裸鼠精神、饮食及排便等状况，用电子天平称量裸鼠体重； 2)
用游标卡尺测量移植瘤的最大直径(L)和最小直径(W)，肿瘤体积用公式V = L ×W2×0.5326 计算，从第4天开始测量，之后2天测量一次，同时测量体重； 3)
接种20-28天后，肿瘤体积达1000-1500 mm3，裸鼠处死，取瘤称重，肿瘤放置液氮或-80oC保存。
将细胞接种于裸鼠左臀大肌背侧，100 ?l/只 (即5×106细胞/只)。
裸鼠接种后放回笼子做好标记裸鼠均给予自由饮水、饮食，SPF饲养。
细胞周期实验
1.细胞准备
1）铺3.5x105细胞于6孔板，培养24 h； 2）血清饥饿24 h；
3）用含10?S血清继续培养24 h； 4）加入400 ul Trypsin消化细胞；
5）加入含10?S血清终止消化，1000 rpm，5min； 6）用1 ml PBS重悬细胞，1000 rpm，5min；
7）小心吸走全部PBS，再准确加入1 ml PBS重悬细胞（吹打30下左右）； 8）转移细胞悬液至2.5 ml预冷的无水乙醇中，充分混匀（吹打30下左右）； 9）-20°C固定过夜（我们做到此部；打包好用干冰快递至上海营养所）；
2.染色与检测（上海营养所完成）： 1）1500 rpm，5 min离心收集细胞；
2）用500 ul PI-solution（用PBS将2.5 mg/ml的PI stock solution稀释成50 ug/ml PI-solution工作液）重悬沉淀；
3）加入0.1 mg/ml RNase A和0.05%Tritin X-100，37°C孵育40 min； 4）加入3 ml PBS，1500 rpm，5 min； 5）弃上清，500 ul PBS重悬沉淀并检测。
细胞免疫荧光染色
盖玻片的处理：酒精擦拭干净→2% HCl 12 h→流水冲洗→蒸馏水冲洗3遍→95%酒精→灭菌→烘干
除非特别说明，否则操作均在室温进行： 1) 2)
Place sterilized coverslips into the 6-well plate.
Add 500 μl of the gelatin-coating solution (0.1% in ddH2O) onto the coverslips and incubate for 10 min. 3) 4) 5) 6) 7)
Remove the gelatin-coating solution and air dry the coverslips for 15 min. Wash the coverslips with PBS Plating the cells onto the coverslips. Transect the cells and culture for 24 h-48 h.
Wash the cells with PBS once and fixed them with 1 ml 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS for 20 min. 8) 9)
Wash the cells briefly with ice cold PBS, 3 times.
Block excess aldehyde groups of the cells with 1 ml 0.1 M glycin for 10 min.
10) Wash briefly with PBS, 3 times.
11) Permeablize the cells with 1 ml PBS-0.5% TX-100 for 10 min. 12) Wash 3 times with PBS-0.1% TX-100, 5 min each.
13) Block the cells with 1 ml 2% BSA in PBS-0.1% TX-100 (ABDB) for 10 min. 14) Add 200 ?l diluted primary antibody (0.5-5 ?g/ml) in ABDB and incubate in a
humidified chamber for 1 h at RT or at 4°C overnight. 15) Wash 3 times with PBS-0.1% TX-100, 5 min each.
16) Add 200 ?l diluted secondary antibody (1-5 ?g/ml) in ABDB to the wells and
incubate for 2 h in the dark.
17) Rinse 3 times with PBS-0.1% TX-100, 5 min each.
18) DAPI staining: add 500 μl of the 0.5 μg/ml DAPI solution (碧云天C1002, 1 ul
stock+1 ml ddH2O+9 ml PBS) to each well and incubate for 1 min. 19) Rinse once with PBS and once with water.
20) Carefully take out the coverslips from the wells and blot to remove any excess