water.
21) Give 10 ?l of 抗荧光淬灭封片液(碧云天 P0126) onto the glass slide. 22) Mount the coverslip with the cells facing towards the microscope slide and leave
it overnight at 4°C.
23) Visualize using a fluorescence microscope. Slides can also be stored in a slide
box at < -20 °C for later examination.
免疫组化实验
玻片的处理：洗干净→泡酸→水洗→95%乙醇→烘干→0.05%多聚赖氨酸处理（用10 ul枪头涂片，干了再涂，共3遍） 1）组织福尔马林固定12 h；
2）组织经组织处理机处理过夜（12-13 h）； 3）石蜡包埋；
4）切片机切片（4-6 um）；
5）切片放进50°C水浴，完全伸展后捞片； 6）65°C固定 2 h或55°C过夜；
7）脱蜡：二甲苯I 30 min→二甲苯II 30 min→100%乙醇15 min→95%乙醇→75%乙醇15 min； 8）ddH2O清洗1 min；
9）抗原修复：将切片放入煮沸的枸橼酸钠缓冲液（pH6.0）10 min，自然冷却到室温（A液：枸橼酸三钠·2H2O 29.41 g + ddH2O 1000 ml；B液：枸橼酸 21g + ddH2O 1000 ml；工作液：A液41 ml + B液 9 ml + ddH2O 450 ml）； 10）ddH2O洗3遍，每次2 min（轻摇）；
11）用纸巾把边缘水分吸干，滴一滴过氧化氢封闭液，封闭5 min（避光）； 12）PBS洗1次，2 min（轻摇）； 13）二抗同源血清封闭20 min（1滴）； 14）一抗（封闭血清稀释），2 h（1滴）； 15）PBS洗2遍，每次2 min（轻摇）； 16）生物素化二抗，30 min（1滴）； 17）PBS洗2遍，每次2 min（轻摇）； 18）加HRP-亲和素，30 min
19）PBS洗2遍，每次2 min（轻摇）；
20) 显色：加反应底物，室温孵育10-30 min至棕色沉淀产生（底物配制：1.6 ddH2O + 5 drop 10x Substrate buffer + 1 drop 50x Peroxidase Substrate）； 21）ddH2O洗1遍，每次2 min（轻摇）； 22）复染：苏木素复染10 s，流水轻柔冲洗;
23）脱水：85%乙醇 15 s→95%乙醇I 15 s→95%乙醇II 15 s→100%乙醇I 5 min→100%乙醇II 5 min→二甲苯I 10 min→二甲苯II 10 min； 24）封片：用中性树脂封片。
石蜡切片的HE染色
1. 组织块浸泡在福尔马林中 12 h (overnight)。 2. 处理机包埋:
提前6 h预热机器，看看程序怎么设置的；脱水后的组织块置于白色小匣子中，标记好，放进机器中进行包埋。
3. 切片机切片(4 ?m)后放入50oC水浴中完全伸展，捞片，65oC固定 2 h 或 55oC 过夜。
注意事项：石蜡块固定好后，在4°C放置一段时间再切片。
4. 脱蜡：二甲苯I，30 min；二甲苯II，30 min；100%乙醇，15 min； 95% 乙醇，15 min；75%乙醇，15 min。 5. ddH2O清洗1 min。
6. 苏木精染色 5 min (在小白盒里，放上架子，放好片子，出水入水时要小心，不要产生大的水花，不能让组织掉下来)。
7. 自来水轻柔冲洗(细流水轻柔冲洗，放好水管的方向，尽量让片子被冲的均匀，10 min)。 8. 95%乙醇5秒。 9. 伊红染色：30 s~2 min。 10. 自来水轻柔冲洗。 11. 用70%乙醇洗涤2次。
12. 脱水： 85%乙醇，15 s；95% 乙醇，30 s；100%乙醇，5 min；100%乙醇，5 min；二甲苯I，10 min；二甲苯II，10 min。 13. 中性树脂（溶于二甲苯的）封片。
BSP and MSP
1． Genomic DNA was isolated from cell lines and primary tissues using a Cell/Tissue DNA
extraction kit (Bioteke, Beijing, China) 。
2． Genomic DNA was modified using EZ DNA methylation-gold kit (ZYMO RESEARCH
CORP, Murphy Ave, USA) following the manufacturer’s directions.
1) Bisul?te modi?cation of genomic DNA was done using primers for BSP and MSP
designed by using the Methyl Primer Express v1.0 software.
2) Primer sequence, annealing temperature, and product size for BSP and MSP assays are
listed in Table 2.The PCR products of BSP were cloned into pMD18-T vector and sequenced.
3) Then results of sequencing were analyzed by Quantification tool for methylation analysis
software.
4) For MSP, the DNA modified by sodium bisul?te was subjected to MSP with primers
speci?cally recognizing the unmethylated or the methylated sequence of RSPO2. Each PCR reaction mix consisted of a total volume of 20 μl
2×GC buffer Taq dNTP (10 mM) bisulfite DNA each primer (10 μM)
The thermo cycler conditions were in general as follows:
94℃ 94℃ specific annealing temperature 72℃ 72℃
3 min 30 sec 45 sec 30 sec 10 min 10 μl 0.5 μl 2 μl 50 ng 1 μl 37 cycles