第一章 研究对象与方法
1.1研究对象
选取2013年3月到2014年3月期间于青岛大学医学院附属医院心内科病房住院的急性心肌梗死患者，釆用病例对照研究。
心肌梗死组：Ml组患者630例，其中男469例、女161例，平均年龄（63.02±9.78）岁。均选自2005年7月至2012年8月入住青岛大学医学院附属第二医院心内科的住院患者，符合世界卫生组织关于缺血性心脏病的命名及诊断标准，其中急性心肌梗死391例，陈旧性心肌梗死239例。
对照组：对照组600例，其中男429例，女171例，平均年龄（62.03±10.05）岁。选自同期因疑似冠心病入住青岛大学医学院附属第二医院心内科的住院患者，均无典型胸痛症状，经心电图、运动平板、心肌酵谱等排除冠心病诊断，所有入选者经冠脉造影证实其主要血管完全正常。
本研究所有受试者均排除了既往炎症相关疾病（包括哮喘、过敏史、关节炎、风湿性心脏病），癌症，慢性肝病，肾衰竭，辦膜性心脏病及其他心脏疾病。所有受试者均为中国青岛地区汉族人，个体之间无血缘关系。对照组与Ml组相比，年龄及性别构成差异均无统计学意义（P>0.05）。该研究在执行过程中严格符合赫尔辛基宣言并获得了医院的伦理委员会的批准。所有入选者均征得患者或其家属同意并签署知情同意书。
我们详细收集了所有研究对象的基本资料，主要包括年龄、性别、身高、体重、体重指数（body mass index，BMI）、吸烟史、高血压史、糖尿病史，以及血浆总胆固醇（total cholesterol，TC）水平、甘油三醋（triglyceride，TG）水平、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein- cholesterol，HDL-C）水平、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）水平。体重指数（BMI）=体重（kg）/ 身高（m2）吸烟史定义为：正在吸烟或既往有吸烟史，吸烟指数（吸烟时间，年X每天吸烟量，支）大于100。高血压诊断标准为:静息时收缩压（systolic blood pressure，SBP）大于140mmHg，或者舒张压（diastolic blood pressure，DBP）大于90minHg，和/或在行降血压治疗。糖尿病的诊断标准为：空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）大于7.8mmol/L和/或在行降血糖治疗。
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1.2研究对象血标本收集及DNA提取 1.2.1 样品的收集管理
向每位研究对象收集血液（抗凝血）有形成分约4ml。从白细胞中提取DNA，完成相关基因型的鉴定。为保障课题样本釆集器械的安全质量，要求抽血时使用统一购置塑胶抗凝真空管（2ml， EDTAK3，标准紫色橡皮密封盖）;采血管上标明患者编号、姓名和病历号;采il前仔细核对研究对象编号和负压釆血真空管编号一致，确认空腹情况（确认是否饮食、饮食品种、数量和时间）。 1.2.2 DNA提取步骤（适用于10ml全血）
1. 登记血样及白细胞保留情况，有问题及时反馈。
2. 估计血样总量为4ml，加入全血血样3倍体积1×的红细胞裂解液至50ml离心管，贴好标签。
3. 用一次性吸管将血样全部吸取至50ml离心管中，并用少量红细胞裂解液清洗取血管2次，清洗液移入50ml离心管，注意样本标签和50ml离心管标签的一一对应，翻转混合多次，直至溶液由混油变澄清。
4. 3500g离心15分钟。（如果离心不彻底可以酌情增加转速或时间） 5. 小心取出离心管，将上清液（为破坏后的RBC碎片）缓慢倒入废液叙，将剩余沉淀充分震荡。
6. 用微量移液器向样品中加入浓度为20ug/ml蛋白酶K 32ul，白细胞裂解液5ml，充分震荡150秒混句至完全液化。
7. 充分混合后，置37℃水浴中孵化30~60分钟。
8. 从水浴锅中取出后，将样本放到-20℃冰箱中冷却5min至室温。 9. 拿出后，加入蛋白沉淀液（-20℃保存）2ml，高速震荡20秒至褐色沉淀出现。
10. 3500rpm离心10min。
11. 离心后，将上清液移至装有5ml异丙醇的管中，注意标签的一一对应，充分轻柔摇混至白色絮状物出现。
12. 3500rpm离心10分钟。
13. 离心后，倾出异丙醇及其他溶液，将离心管倒置在滤纸上大约10-15分钟至挥发干净。
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14. 向其中加入75%酒精（-20℃保存）清洗DNA及脱盐，3500rpm离心10min。
15. 离心后倾出酒精，倒置于新滤纸上干燥15分钟。 16. 加入DNA储存液0.8ml，放置室温过夜。
17. 第二天测定DNA纯度与浓度并做记录，分装DNA保存于4°C或更低温度。
1.2.3 聚合酶链反应(PCR)扩增
各基因型检测的PCR引物序列已在之前的文献中详细介绍。引物在生工生物工程（上海）有限公司合成。PCR扩增包含CCL5 rs 2107538位点，反应总体积为25ul，其中20μM的引物各lμl，Taq DNA聚合酶0.1μl，dNTP2μl，MgCh DNA模板Iμl，l0×PCR buffer 2.5μl补水至25μl。反应条件：95℃预变性2分钟，95℃变性40秒，50℃退火40秒，72℃延伸40秒，1个循环。95℃变性40秒，50℃退火40秒，72℃延伸40秒，34个循环。72℃延伸5分钟，保存于4℃。
PCR增包含CCL2rs024611位点，反应总体积为30μl，其中20μM的引物各1μl，TaqDNA聚合酵0.1ul，dNTP2ul，MgCl21.5μl，DNA模板Iμl，lOxPCRbuffer3III补水至30til。反应条件：95℃预变性5分钟，94℃变性40秒，52℃退火30秒，72℃延伸30秒，1个循环。94°C变性40秒，52°C退火30秒，72°C延伸30秒，29个循环，72°C延伸10分钟，保存于4°C。PCR扩增包含rs333位点，反应总体积为25μl，其中20nM的引物各Iμl，TaqDNA聚合酶
dNTP2μ1，MgCb1.5μ1，DNA模板Iμl，补水至25μ1。反应条件:95°
C预变性2分钟，95℃变性20秒，62℃退火60秒，72°C延伸30秒，1个循环。95℃变性20秒，62℃退火60秒，72t:延伸30秒，31个循环。72°C延伸5分钟，保存于4°C。CCR5基因扩增的产物直接用2%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定分析，凝胶显像仪下观察、记录、拍照。电泳过程使用TaKaRa公司的DL500DNAMarker。其由50bp、500bp的DNA片段组成，第一条带的DNA片段长度为50bp，在50bp、200bp之间的每个DNA片段间相差50bp，在200bp~500bp之间的每个DNA片段间相差100bp。整个Marker梯度句称清晰。当纯合突变发
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生32个碱基缺失时，则出现一个190 bp的片段。在本研究中所有受试者中均未发现CCR 532突变基因型。
PCR扩增包含CCR2 rsl 799864位点，反应总体积为25μl，其中20μM的引物各TaqDNA聚合0.1μl，MgCI2 1.5μl，DNA模板1μl，10×PCR buffer 2.5μl补氷至25μl。反应条件：94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，57.3℃退火30秒，72℃延伸30秒，1个循环。94℃变性30秒，57.3℃退火30秒，72℃延伸30秒，34个循环，72℃延伸5分钟，保存于4℃。
琼脂糖凝胶的配置：在称量好琼脂糖粉末中加入适量的TAE缓冲液，微波炉加热煮满两次并摇匀，稍微冷却后以0.1μl/ml的浓度加入Gel Red染料，均匀倒入制胶架中，赶走气泡，待30分钟后凝胶凝固；将PCR扩增产物在此凝胶中跑胶，电压控制在100-120V，约40分钟后在Gel Doc 2000凝胶成像系统上观察实验结果。 1.3 仪器与试剂 1.3.1实验仪器
（1）常用的一般实验器材（北京百泰克生物技术有限公司）
（2）微量加样器（2.5 Hi、10 Hi、20 Hi、100 uU 500 n 1、1000wl）（德国 Eppendorf） （3）-80°C超低温冰箱（美国Thermo Forma） （4）-2℃冰箱（青岛海尔公司）
（5）漩祸混合器（上海医科大学仪器厂） （6）BACKMAN离心机（德国） （7）Sigma3kl5离心机（德国） （8）Sigina3k30离心机（德国）
（9）电热恒温水浴箱（上海精宏实验设备有限公司DK-8D型） （10）DU800核酸蛋白分析仪（德国Beckman DU800） （11）超纯水系统（siMPLicnr）
（12）定量 PCR 仪（Applied Biosystemsl2720, USA） （13）Midea微波炉
（14）Bio-rad maxi电泳槽（北京六一仪器厂） （15）DYY-6C型电泳仪（北京六一仪器厂）
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（16）UVP凝胶成像分析系统（北京赛宝奥科技有限公司） （17）202- ZA型电热恒温烤箱（上海阳光实验仪器公司） （18）MDF- U50V- 86e低温冰箱（日本三洋公司） （19）PeR扩增仪Mastereycler5333（德国Eppendorf公司） （20）DYY-HIZ稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂） （21）医用微波炉（上海中达医学应用研究所）
（22）Eppendorf Research移液器（德国Eppendorf公司） （23）DYY-III 28 A型电泳槽（北京六一仪器厂）
（24）凝胶成像分析仪Alphalanger 2200（美国Anlai公司） （25）SW-CJ- 2FD型净化工作台（苏州安泰空气技术公司） （26）离心机LXJ- 64- 01（北京医疗仪器修理厂） （27）台式离心机PQ- 1600A（上海培清科技有限公司） （28）电子天平PB3O22- S（瑞士Mettler公司） 1.3.2实验试剂
（1）Triton- X100 （Sigma） （2）三经甲基氨基烷(Tris) （Sigma） （3）乙二胺(EDTA) （Sigma） （4）十二烷基磺酸钠(SDs) （Sigma） （5）蛋白酶K （Merck，Germany） （6）10 mmol/L dNTPs （赛百盛生物有限公司） （7）琼脂糖 （Sigma） （8）溴化己锭 （Sigma） （9）100 bp DNA ladder （赛百盛生物有限公司） （10）Taq- DNA聚合酶 （赛百盛生物有限公司） 限制性内切酶：(Mnll，Bshl236x)
（11）Mnll （生工生物工程有限公司） （12）Bshl236I （生工生物工程有限公司） （13）引物合成 （赛百盛生物有限公司）
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