13. 离心后倾出异丙醇及其他溶液将离心管倒置在滤纸上大约10-15分钟至挥发干净。
14. 向其中加入75%酒精（-2℃保存）清洗DNA及脱盐3500rpm离心10min。 15. 离心后倾出酒精倒置于新滤纸上干燥15分钟。 16. 加入DNA储存液0.8ml放置室温过夜。
17. 第二天测定DNA纯度与浓度并做记录分装DNA保存于4℃或更低温度。 1.6.3 引物的合成：
VEGF?1154G/A 多态特异性引物：
上游引物：5'-TCCTGCTCCCTCCTCGCCAATG-3' 下游引物：5'-GGCGGGGACAGGCGAGCATC-3' 236bp，GC%：70.76% VEGF+405G/C 多态特异性引物
上游引物：5'-ATTTATTTTTGCTTGCCATT-3' 下游引物：5'-GTCTGTCTGTCTGTCCGTCA-3' 234bp，GC%：61.97%
1.6.4 扩增 VEGF?1154G/A 和+405G/C 基因的反应体系：
灭菌的去离子水 9.95μl 10*PCR 缓冲液 1.5μl PCR 染料 1.5μl 上游引物（10pmol/ul） 0.25μl 下游引物（10pmol/ul） 0.25μl 10 mmol/L 脱氧核糖核苷酸（dNTPs） 0.3μl Taq 酶（5u/ul） 0.25μl 模板 DNA 1μl
上述步骤加液完成后轻摇混匀，以离心机短暂离心，使反应液集中于管底。 1.6.5 反应条件：
首先给予2min的94℃预变性处理，然后以94℃进行变性15s，55℃退火15s，在72℃下延伸25s，等完成35个完整循环后，再于72℃进行延伸3min。PCR
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完成后，可在琼脂糖凝胶上以100bpDNAladder水平进行电泳，从而确定扩增片段长度。
1.6.6 制备琼脂糖凝胶
分别称取琼脂糖粉末 2 g、4 g，将粉末溶解于 100 ml 1×TAE 中，加入并混匀于椎形瓶中，在微波炉内加热至熔融状态，取出后加入 0.5μg/ml的溴化乙锭 10μl，混匀后将熔融的液体倒入胶板上使之冷却，以备后用。 1.6.7 对 PCR 产物的分析如下： 1 将胶板放于水平电泳槽之内。
2 将稀释后 1×TAE 液，置入电泳槽，以稍微高出于胶面为最宜。 3 吸取 3μl 扩增产物（其余的则置于 4℃保存备用）上样于琼脂糖凝胶 上电泳，必要时可以同时上样于阴性对照（即不加模板 DNA，而是用灭 菌的去离子水替代的 PCR 产物）和阳性对照（指经多次实验获得稳定 PCR 产物），同时选择 100bp DNAladder 给予水平电泳处理。 4 通电后稳压 100 V，将电泳时间设定为 10 分钟。
5 电泳结束的时候取出凝胶，在紫外灯下和 Marker 条带比较，判定扩 增片段的长度。 6 基因型分析
VEGF+405G/C的PCR产物的电泳条带长度是304bp。用BsmFI对PCR产物进行酶切，进行一下操作：在1个1.5ml灭菌Eppendorf管中按顺序加入以下所列试剂成分（反应体系为10μl）：10×Buffer0.5μl，BSA0.5μl，BsmFI0.5μl，PCR产物6μl，灭菌的石蜡油8μl。短暂离心上述混合液后置于65℃温箱中给予过夜消化。上述酶切反应结束之后，吸取全部已经消化的产物，上样于3%的琼脂糖凝胶，同时上样于阴性对照（同前）、阳性对照，同时选择合适分子量DNAMarker进行标记。通电，稳压100V，电泳时间为30-50分钟。待电泳结束后，取出凝胶，在凝胶成像仪下观察酶切结果。VEGF基因3′非编码区+405核苷酸位点处G为C所替代，从而产生一个BsmFI限制性酶切位点。C/C基因型经限制性内切酶消化后的片段为304bp，G/G基因型则为193bp和111bp，G/C杂合基因型为304bp、193bp和111bp三个碱基片段。
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VEGF-1154G/A采用聚合酶链反应一限制性内切酶片段长度多态性(PCR—RFLP)方法进行基因分型分析。引物由赛百盛生物公司合成。基因型检测的PCR反应体系为20μl：模板DNA100ng，10×PCR缓冲液(含MgC1215mmol/L)1.6μl，染料2．0μl，TaqDNA聚合酶1.0U，10mmol/LdNTPs0.4μl，上下游引物各250nmol/L；PCR反应参数：94℃预变性5min，然后94℃变性45s，61℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环后，72℃继续延伸7min。VEG-1154G/A扩增产物为206bp，PCR产物经限制性内切酶MnlI于37℃酶切16h后，进行3％琼脂糖凝胶电泳。A等位基因有一个MnlI内切位点，G等位基因有两个MnlI内切位点，因此A/A基因型产物为184bp和22bp2条片段，G/G基因型为150、34和22bp3条片段，G/A基因型为184、150、34bp和22bp4条片段。 1.7 统计学分析方法
本研究所有资料均经过Microsoft Excel软件建立数据库，应用SPSS19.0软件包对数据进行统计学分析，检验水准a=0.05，即P<0.05说明具有统计学差异。所有的统计检验均为双侧概率检验。 1.5.1 —般资料的分析
采用独立样本t检验比较各组间胎龄、出生体重差异；采用卡方检验比较性别的组间差异。
1.5.2.Hardy- Weinberg平衡检验
本研究釆用χ2检验分析组间各SNP位点基因型是否符合Hardy-Weinberg平衡，以判定样本的群体代表性。Hardy-Weinberg平衡实质是一种理想状态，我们很通过检测每一个体的基因型來获得一个很大的群体的等位基因频率，但可以通过从群体中随机抽取一定数量个体作为样本来估计群体中的等位基因频率。因此就必须要对所抽取的样本进行检验以确定所取样本的代表性。 1.5.3 SNP位点分析
对单个SNP位点，基因型与等位基因频率在病例组与对照组的统计学差异分析采用χ2检验。多组中的两两比较采用Bonferroni法校正检验水准。通过Logistic回归模式校正其它风险因素，并分析相关SNP各基因型对ROP发病风险程度的影响，计算比值比（Odds ratio，OR）和95%可信区间（confidence interval，CI）。
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应用SPSS 19.0软件包进行统计学处理。釆用拟合优度检验进行Hardy-Weinberg平衡检验确认研究样本的群体代表性。以χ2验和t检验比较人口学特征、冠心病危险因素和各基因型及等位基因在病例与对照之间分布的差异。比值比（oddsratios，OR）及其95%可信区限（confidence intervals，CI）表示相对风险度。通过非条件Logistic回归分析校正传统的冠心病危险因素（cardiovascular risk factors，CRF）后估算基因型与表型的相关性。未校正的OR值（crude OR）和校正后的OR值（adjusted OR）分别经单因素分析和多因素Logistic回归分析计算得出。应用Power and Sample Size Program进行检验效能（power）的估算。根据目前的样本含量，假设对照组中最小等位基因频率为17%而I型错误的概率为0.05，当OR=1.4时该研究具有90%的检验效能。应用Thesiasprogram进行连锁不平衡（linkage disequilibrium）的估计和单体型（haplotype）的构建，并进行单体型频率的计算和协变量校正后的单体型作用的分析。P<0.05表示差异无统计学意义。
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第二章 实验结果
1 两组研究对象的一般特征
急性心肌梗死患者组及健康对照组的人口分布特征：心肌梗死组：Ml组患者630例，其中男469例、女161例，平均年龄（63.02±9.78）岁。均选自2005年7月至2012年8月入住青岛大学医学院附属第二医院心内科的住院患者，符合世界卫生组织关于缺血性心脏病的命名及诊断标准，其中急性心肌梗死391例，陈旧性心肌梗死239例。对照组：对照组600例，其中男429例，女171例，平均年龄（62.03±10.05）岁。选自同期因疑似冠心病入住青岛大学医学院附属第二医院心内科的住院患者，均无典型胸痛症状，经心电图、运动平板、心肌酵谱等排除冠心病诊断，所有入选者经冠脉造影证实其主要血管完全正常。两组患者的年龄构成比均无统计学意义（P＜0.05）。
2 VEGF-460 T/C和- 1154G/A单核苷酸多态性分布与急性心肌梗死发病风险相关性分析
所有研究对象的DNA标本均经PCR- RFLP方法成功检测了VEGF- 460 T/C和-1154G/A两位点的基因型，并且所有重复分型结果均与原始结果相符。 2.1 VEGF-460T/C单核营酸多态性分布与急性心肌梗死发病风险相关性分析
健康对照组中的VEGF-460T/C单核昔酸多态性的基因型分布均符合Hardy- Weinberg平衡（P>0.05），可以认为其具有良好群体代表性。急性心肌梗死患者组VEGF- 460T/ CSNPT和C等位基因频率分别为72.5%、27.5%；健康对照组中等位基因频率分别为79.9%、20.1%；急性心肌梗死组中C等位基因频率明显高于健康对照组，两组比较有统计学意义（χ2=6.109，P=0.013）。急性心肌梗死患者组和健康对照组的T/T、T/C和C/C基因型频率分别为52.5%、40.0%、7.5%；63.2%、33.3%和3.4%。由于C/C基因型频率较低，遂将T/C与C/C基因型合并。合并后急性心肌梗死患者组的T/T、T/C+C/C基因型频率分别为52.2%、47.5%；健康对照组基因型频率分别为63.2%、36.7%。两组间基因型分布有统计学意义（χ2=4.445，P=0.029）。与T/T基因型比较，携带C等位基因的基因型（T/C+C/C）可显著增加急性心肌梗死的发病风险，OR=1.692，95% CI=1.123-2.549。
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