仪（上海琪特分析仪器有限公司）；YXJ-2离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；H6-1微型电泳槽（上海精益有机玻璃制品仪器厂）；凝胶成像系统（Gene Genius公司）； 移液器（范围 100-1 000μl，20-200μ1， 0.5-10μ1）（加拿大 BBI公司)。 主要试剂
TaqDNA聚合酶、1 OxPCR Buffer（without Mg2+： 100 mM Tris-HCl pH 8.8 at 25。C；500 mM KCl， 0.8%（v/v）Nonidet ）； MgCh （25mM）、dNTP （lOmM）、Marker、6XDNA Loading Dye （生工）；PCR产物纯化回收试剂盒（生工SKU41）； lOxTAE（400mM Tris-acetate and lOmM EDTA， pH8.0）。（3） PCR反应体系（25ul体系）：ddH2018.75ul； dNTP Mixture（各2.5Mm） 2ul； lOxPCRbuffer（Mg2+plus）2.5ul； PF（lOuM） 0.3ul； PR（10uM）0.3ul；模板DNA（10ng/ul）lul；rTaq（5U/ul） O.lSuLPCR反应条件：95℃ 5min； 94℃ 30sec； 60℃ 30sec 35 cycles； 72℃ 30 sec； 72℃ 10min； 10℃ forever。1%琼脂糖电泳，150V、100mA 20min电泳观察。（4）测序：PCR产物纯化回收试剂盒（生工SK1141），测序。 2.3.4实验室的质量控制
主要通过采取以下手段对实验室的检测结果予以控制: （1）釆取有效措施避免交又污染;
（2）在对模板进行分配时，采取双人操作，确保研究对象和样品之间的相对应; （3）每个位点分析结束，分别抽出5%_10%的样品进行重复检测，保证一致率在99%以上；
（4）基因型的检测均采用盲法操作。 2.3.5 试剂的配置
红细胞裂解液配置（10×原液，配置基数1000ml）
1. 室温下，秤量氯化铵（分析纯）82.9g、碳酸氢钾（分析纯）5g、乙二胺四乙酸二纳（分析纯）0.372g加入1000ml清洗干净的烧杯中，加入双蒸水约800ml；
2. 将烧杯放到在磁力槐拌器上搜拌，至溶液完全透明澄清，使用加热功能调节溶液温度至25摄氏度，调定溶液pH值至7.4，PH调整完毕，将烧杯中的溶
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液转移入1000ml的容量瓶中，清洗烧杯三次，最后加入双蒸水定容至1000ml，颠倒混句；
3. 将配置好的溶液，用漏斗进行过滤，过滤后盛放在一个耐高压的玻璃瓶中，放入高压锅，经过0.15 Mpa消毒20分钟，待冷却后，封口，贴上标签、配制日期及配置者，稀释成1×工作液即可使用，室温放置。 2.3.6 白细胞裂解液配置（配置基数1000ml）
1. 室温下，种量氯化纳（分析纯）23.38g、Tris-base（分析纯）1.211g、乙二胺四乙酸二纳（分析纯）1.862g、SDS（分析纯）5g加入1000ml清洗干净的烧杯中，加入双蒸水约800ml；
2. 将烧杯放到在磁力搅拌器上搅拌，至溶液完全透明澄清，使用加热功能调节溶液温度至25摄氏度，调定溶液pH值至8.0，将烧杯中的溶液转移入1000ml的容量瓶中，清洗烧杯三次，最后加入双蒸水定容至1000ml，颠倒混匀；
3.将配置好的溶液，用漏斗进行过滤，过滤后盛放在一个耐高压的玻璃瓶中，放入高压锅，经过0.15 Mpa消毒20分钟，待冷却后，封口，贴上标签、配制曰期及配置者，室温放置。
2.3.7 蛋白沉淀液配置（配置基数1000ml）
1. 室温下，秤量醋酸铵500g，加入1000ml清洗干净的烧杯中，加入双蒸水约800ml；
2. 将烧杯放到在磁力揽拌器上挽拌，至溶液完全透明澄清，使用加热功能调节溶液温度至25摄氏度，调定溶液pH值至7.4，将烧杯中的溶液转移入1000ml的容量瓶中，清洗烧杯三次，最后加入双蒸水定容至1000ml，颜倒混匀；
3. 将配置好的溶液，用漏斗进行过滤，过滤后盛放在一个耐高压的玻璃瓶中，放入高压锅，经过0.15Mpa消毒20分钟，待冷却后，封口，贴上标签、配制曰期及配置者，-20摄氏度保存备用。 2.3.8 DNA储存液（配置基数1000ml）
1.室温下，秤量Tris-base（分析纯）1.21Ig、乙二胺四乙酸二纳（分析纯）0.372g加入1000mI清洗干净的烧杯中，加入双蒸水约800ml；
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2.将烧杯放到在磁力搅拌器上挽拌，至溶液完全透明澄清，使用加热功能调节溶液温度至25摄氏度，调定溶液pH值至8.0，将烧杯中的溶液转移入1000ml的容量瓶中，清洗烧杯三次，最后加入双蒸水定容至1000ml，颠倒混句；
3.将配置好的溶液，用漏斗进行过滤，过滤后盛放在一个耐高压的玻璃瓶中，放入高压锅，经过0.15Mpa消毒20分钟，待冷却后，封口，贴上标签、配制曰期及配置者，室温保存。
2.3.9 75 %酒精配置（配置基数1000ml）
向清洗干净的1000ml量筒中加入750ml的无水酒精，然后加蒸馆水至满刻度，即为75%的酒精，用瓶装好，贴上标签、配制日期及配置者，-20摄氏度保存。蛋白酶K的配置（配制标准：20mg/ml）。
将200mg的蛋白酶K加入到9.5ml水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解。不要涡混合。加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20摄氏度。电汰缓冲液：（5×TBE，配置基数1000ml）。
54g Tris减和27.5g硼酸溶于900 ml双蒸水，再加入0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）20 mL，定容至1000 mL，室温下存。 2.3.10 基因多态性检测
采用聚合酶链反应一限制性内切酶片段长度多态性（Polymerase chain reaction- restrietion fragment length polymorphism，PCR-RFLP）方法对VEGF- 460 T/C和-1154 G/A基因SNP进行基因分型。 2.3.10.1 VEGF- 460T/CSNP基因分型
VEGF- 460T/c基因型检测的PCR反应体系为20μl，其中模板DNA 100ng，10×PCR缓冲液（含MgCI2 15mmol/L） 1.6μl，染料2.0μl ，Taq DNA聚合酶1.0 U，10mmol/L dNTPs 0.4μl，上游引物(5’-TGTGCGTGTGGGGTTGAGCG-3’)和下游引物(5’-TACGTGCGGACAGGGCCTGA-3’)各250nM；PCR反应条件为：94℃预变性5min，然后94℃变性45s，61℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环后，72℃继续延伸7min。PCR扩增产物为175bp，PCR产物经限制性内切酶Bsh1236I于37℃酶切16h后，进行4%琼脂糖凝胶电泳。C/C基因型存在Bsh1236I的识别位点产生155bp和20bp两条DNA片段，而T/T基因型缺乏Bsh12361的
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识别位点保持原有PCR后的175bp的片段，T/C基因型则显示为175bp、155bp和20bp 3条片段。
2.3.10.2 VEGF-1154G/A SNP基因分型
VEGF- 1154G/A基因型检测的PCR反应体系为20μl，其中模板DNA100ng，10×PCR缓冲液（含MgCl2 15mmol/L)1.6μl，染料2.0μl，Taq DNA聚合酶1.0U，10mmol/L dNTPs 0.4μl，上游引物(5’-TCCTGCTCCCTCCTCGCCAATG-3’)和下游引物(5’-GGCGGGGACAGGCGAGCATC-3’)各200nM；PCR反应条件为：94℃预变性5min，然后94℃变性45s，61℃退火45s，72oC延伸45s，35个循环后，72℃继续延伸7min。扩增产物为206bp，PCR产物经限制性内切酶Mnll于37℃酶切16h后，进行4%琼脂糖凝胶电泳。A等位基因有一个Mnll内切位点，G等位基因有两个Mnll内切位点，因此A/A基因型产物为184bp和22bp两条片段，G/G基因型为150bp、34bp和22bp3条片段，G/A基因型为184bp、150bp、34bp和22bp4条片段。 2.3.10.3 实验质量控制
为避免细菌的污染及防止实验交叉污染，EP管、Tips等均为一次性，并于应用前严格消毒。并严格遵循实验操作规则。每一批PCR都以去离子水代替DNA模板进行扩增作为阴性对照。对每个多态性位点随机挑取10%的DNA标本进行重复分型分析，以证实分型方法的可靠性。 2.3.10.4 血管内皮功能测定
采用Celmajar首创的应用高分辨率超声测定肱动脉反应性充血前后血管内径的变化来评价血管内皮功能，采用仪器为Phlipis Agilent SONOS 5500彩色多普勒超声机，探头频率7.5MHz，探查深度4-5cm，患者测试前静卧10min，上肢外展15度，连接3导联心电图，将超声探头置于右臂肘上2-5cm，显示肱动脉长轴切面，获得清晰图像，在心电图显示R波时测肱动脉前后内膜之间的距离作为血管基础内径D1，并于探头测定位置做标记。后行反应性充血实验，将血压带在肘关节以下充气加压至300mmHg，持续5min后放气，60-90s内在同一标记位置测量肱动脉内径D2，所有数值均连续测量3个心动周期，然后取平均值。反应性充血后内径变化即血流介导的血管内皮舒张功能FMD=（D2-D1）
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/D1x100%。血管内皮功能检测前12小时停止抽烟、喝咖啡，停用所有扩血管药、抗氧化剂，同时避开女性月经周期。 1.6 血标本的采集及DNA的提取 1.6.1 样品的收集管理
向每位研究对象收集血液（抗凝血）有形成分约4ml。从白细胞中提取DNA，完成相关基因型的鉴定。为保障课题样本釆集器械的安全质量，要求抽血时使用统一购置塑胶抗凝真空管（2ml，EDTAK3，标准紫色橡皮密封盖）；采血管上标明患者编号、姓名和病历号；采样前仔细核对研究对象编号和负压釆血真空管编号一致，确认空腹情况（确认是否饮食、饮食品种、数量和时间）。 1.6.2 DNA提取步骤（适用于10ml全血）
1. 登记血样及白细胞保留情况有问题及时反馈。
2. 估计血样总量为4ml加入全血血样3倍体积1×的红细胞裂解液至50ml离心管贴好标签。
3. 用一次性吸管将血样全部吸取至50ml离心管中并用少量红细胞裂解液清洗取血管2次清洗液移入50ml离心管注意样本标签和50ml离心管标签的一一对应翻转混合多次直至溶液由混油变澄清。
4. 3500g离心15分钟。（如果离心不彻底可以酌情增加转速或时间）。 5. 小心取出离心管将上清液（为破坏后的RBC碎片）缓慢倒入废液叙将剩余沉淀充分震荡。
6. 用微量移液器向样品中加入浓度为20ug/ml蛋白酶K32ul白细胞裂解液5ml充分震荡150秒混句至完全液化。
7. 充分混合后置37°C水洛中孵化30~60分钟。
8. 从水浴锅中取出后将样本放到-2℃冰箱中冷却5min至室温。
9. 拿出后加入蛋白沉淀液（-2℃保存）2inl高速震荡20秒至褐色沉淀出现。 10. 3500rpm离心10min。
11. 离心后将上清液移至装有5ml异丙醇的管中注意标签的一一对应充分轻柔摇混至白色絮状物出现。
12. 3500rpm离心10min。
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