1.4 外周血白细胞DNA的提取
采集每位研究个体的静脉血5ml，经构椽酸钠抗凝，置4℃冰箱保存，并于采血后1周内提取外周血白细胞DNA。
DNA提取采用蛋白酶K消化-饱和氯化钠盐析法。具方法：外周血5ml加冷蒸馏水至50ml，2500rpm室温离心10min，弃上清。重复2~3次至红细胞完全裂解。加入预冷的0.1% Triton-X 10045ml用以上方法再次离心去上清，并洗涤1~2次。于沉淀中加入3ml DNA提取液，充分混匀，悬浮白细胞，加10% SDS 150μl（终浓度0.5%）剧烈振荡至无凝块。加入蛋白酶K至终浓度为100μg/ml（1mg/ml约400ul），混匀，37℃消化过夜。然后，加入5mol/L的NaCl 1.2ml，剧烈振荡15s，2500rpm室温离心15min。将上清倒入另一离心管中，弃沉淀。上清液中加入100%乙醇8ml，颠倒混匀，挑出DNA至高压灭菌的Eppendorf管中，以70%乙醇洗涤1~2次，倒置Eppendorf管井使乙醇挥发干净。以200μl TE溶解DNA，4℃至少放置24h，彻底溶解后经电泳或测OD值定量。 1.5 DNA纯度的测定
紫外分光光度仪测量260nm和280nm两个波长处的吸光度，通过计算A260/280来检测各个样本DNA浓度和纯度。将各个样本DNA浓度调整一致，-20℃保存待用。
1.5.1 各基因SNP位点及引物
釆取候选基因策略，参考相关文献，选取候选基因及SNP位点，釆用PrimerPremier5.0软件，结合引物设计原则设计各多态性位点引物。 1.5.2 SNPs基因分型:
大部分的SNP基因分型由上海邃志生物技术公司使用美国西昆诺姆公司(Sequenom， Inc.)的MassARRAY实验平台提供检测服务，该平台主要是基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)的核心技术。通过PCR扩增，SAP酶处理，延伸引物弟碱基延伸，树脂除盐纯化，芯片点样，质谱检测等实验步骤，最终使用Typer4.0软件分析实验数据，获得基因分型结果。(1)原理:将念有目标SNP的DNA序列进行PCR扩增后，加入SNP序列特异延伸引物，在SNP位点上，延伸1个碱基。然后将制备的样品分析物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管，而后用瞬时纳秒(10-9S)强激光激发，由于基质分
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子经福射后能吸收能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子，产生的离子多为单电荷离子，这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能，进而在一非电场漂移区内按照其质荷比率加以分离，在真空小管中飞行到达检测器。MALDI产生的离子常用飞行时间(Time-of-Flight，TOF)由检测器来检测，离子质量越小，就越快到达。理论上讲,只要飞行管的长度足够,TOF检测器可检测分子的质量数是没有上限的。 1.5.3 PCR反应
I.根据已抽提样品编制384孔反应表,注明每孔对应的DNA样品的编号和所用引物。II.按表在384孔板各孔中分别加入luLDNA模板,贴膜,2000 rpm / 10秒离心后备用。III.按下表配制PCR反应液:(以样本为例)
表 1 PCR反应液配方 Table 1 PCR reaction liquid formula
试剂名称 H2O
PCR Buffer(10×, 含15mM MgCl2) MgCl2 (25mM) dNTP(2.5 mM each) 引物使用液 Hotstar Taq(5U/μL) 终体积
1 rxn(μL) 0.95 0.625 0.325 1 1 0.1 4
384 rxn(μL) 380 250 130 400 400 40 1600
注:以上384孔反应液有4%过量。
IV.取一排12联管,每孔加入配置好的PCR反应液133μL,短暂离心后备用。 V.用10ul排枪取12联管中PCR反应液4ul,加入已有luLDNA的384孔板中,使各孔终体积为5ul。(注意枪头不要碰到384孔板中的DNA样品,如果碰到需调换枪头)
VI.将装有5ul反应液的384孔板短暂离心后放入PCR仪,运行名为“PCR\的反应程序。
VII. PCR反应程序结束后,将384孔板短暂离心后备用,可在4°C保存。 ③SAP处理I.配制SAP反应液按以下表次序配制SAP反应液(以样本为例)
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表 2 SAP反应液配方 Table 2 SAP reaction liquid formula
试剂名称 H2O
SAP Buffer(10×) SAP酶(1U/μL ) 终体积
1 rxn(μL) 1.53 0.17 0.3 2
384 rxn(μL) 612 68 120 800
注:以上384孔反应液有4%过量。
II.取一排12联管,将SAP反应液以每孔66μL分装,短暂离心后,用lOul排枪分装于384孔PCR反应板,每孔加2μL,封膜、离心。
IIL将已加入SAP反应液的384孔板放入PCR仪中,运行名为\”的反应程序。SAP程序:37℃,40min→85℃, 5min→4℃, forever IV.反应结束,将384孔板取出短暂离心备用。 ④延伸反应
I.配制iPlex反应试剂
表 3 iPlex反应液配方 Table 3 iPlex reaction liquid formula
试剂名称 H2O
iPlex Buffer(10×) iplex Termination mix 引物使用液 iPlex enzyme 终体积
1 rxn(μL) 0.755 0.2 0.2 0.804 0.041 2
384 rxn(μL) 302 80 80 321.6 16.4 800
注:以上384孔反应液有4%过量。
II. 取一排12联管，将iPlex反应液以每孔66μL分装，短暂离心后，用10uL排枪分装于384孔PCR反应板，每孔加2hL，封膜、离心。
III.将已加入iPlex反应液的384孔板放入PCR仪中，运行名为“extension”的反应程序。
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IV.反应结束，将384孔板取出短暂离心备用。
⑤.产物纯化I.取6mg树脂在384孔树脂刮板上，均匀覆盖，刮去多余的树脂，放置20min。II.将反应结束的384孔板lOOOrpm离心Imin，每孔加入25μL去离子水，倒置在树脂板上面(注意固定，不能移位)，然后反置将树脂板扣在384孔板上，敲击使树脂落入384孔板，封膜。III.以384孔板的长轴为轴心，翻转384孔板20分钟，3500rpm、5分钟离心后备用。 ⑥检测I.
Nanodispenser SpectroCHIP 芯片点样将检测样品从384孔反应板转
移到表面覆盖基质的MassARRAY SpectroCHIP芯片。II. MassARRAY Analyzer Compac 质谱检测将样品转移到SpectroCHIP芯片后，即可放入质谱仪进行检测，每个检测点只需3-5秒，全自动分析。III.TYPER软件分析实验结果，获得分型数据。
1.5.4 PCR的电泳检测
ACEI/D多态性釆用PCR电泳法检测，在妇幼保健院中心实验室完成，方法如下: ⑴试剂 ①.6xloa(iing
buufer (上海莱枫)
②.琼脂糖(生工生物) ③.DL2000 Marker(上海莱枫) ④.dNTP
(上海莱枫)
⑤.rs4340引物(生工生物合成) ⑥.Taq酶(上海莱枫)
⑦.DL2000 Marker(上海莱枫) (2)仪器与设备 ①.电子分析天平 ②.SMA1000浓度测试仪 ③.电热恒温水浴锅 ④.台式离心机(Thermol) ⑤.96孔板离心机(Eppendorf) ⑥.电泳仪
⑦.凝胶成像仪(上海天呈)
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⑶质检
① SMA 1000进行DNA浓度测定:
I 打开SMA1000软件,选择测量的样品种类为DNA。 II 测量前用去离子水对测量平台以及取样臂进行清洗2-3次。 III 以2μLDNA样品溶解溶液为空白对照。 IV 吸取2μL待测DNA样品进行样品测量。 V 记录测定数据,并进行保存。 ② PCR扩增rs4340引物验证:
I在96孔板中加入18nL PCR Master Mix反应液。再加入2nL DNA样本,终体 积为20μL。
表 4 PCR Master Mix反应液配方 Table 4 PCR Master Mix reaction liquid formula
试剂名称 H2O PGR Buffer dNTP(2.5 mM each) rs4340引物-F
CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT re4340引物-R GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT Taq 酶 终体积
1X(μL) 13.2 2 1.6 0.4 0.4 0.4 18
II将96孔板lOOOrpm离心1分钟后放入PCR仪,运行反应程序。
III将PCR产物进行凝胶电泳,查看扩增条带。PCR产物为490bp,判断基因型为插入型,PCR产物为190bp,判读为缺失型,PCR产物为190bp和490bp时,判断为插入和缺失的杂合型结果。 1.5.5 DNA测序实验
ND +597 C/A多态性釆用DNA测序法检测，在深圳市妇幼保健院中心实验室完成，方法如下：（1）实验伩器：PCR反应扩增仪（加拿大BBI公司）；3730测序列分析仪（美国ABI公司）；SW-CJ-1D洁净工作台（江苏苏洁净化设备厂）；DK-8D型电热恒温水槽（上海森信实验仪器有限公司）；DYY-8型稳压稳流电泳
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