上海欧耐施生物技术有限公司—品控部
饲料酶活性测定方法
上海欧耐施生物技术有限公司品控部编制
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目录
附录A 木聚糖酶酶活力活力测定方法 ....................................................................................................... 1
附录B β-葡聚糖酶活力测定方法................................................................................................................5
附录C甘露聚糖酶酶活力测定方法...............................................................................................................9
附录D 纤维素酶酶活力测定方法...............................................................................................................13
附录E 果胶酶酶活力测定方法...................................................................................................................17
附录F α-淀粉酶酶活力测定方法..............................................................................................................20
附录G 蛋白酶酶活力测定方法...................................................................................................................30
附录H α-半乳糖苷酶酶活力测定方法......................................................................................................35
附录I 植酸酶酶活力测定方法....................................................................................................................38
附录J 糖化酶酶活力测定方法....................................................................................................................42
附录K 真菌α淀粉酶酶活力测定方法.......................................................................................................44
附录L 脂肪酶酶活力测定方法....................................................................................................................46
附录M 木瓜蛋白酶酶活力测定方法..........................................................................................................49
常用标准溶液的配制和标定........................................................................................................................52
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附录A
木聚糖酶活力的测定方法 （GB/T23874-2009）
A1 应用范围
本标准规定了用分光光度法测定饲料添加剂中木聚糖酶的活力。 本标准适用于饲料添加剂木聚糖酶产品，最低检出限为10.0U/g。 A2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注册日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注册日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 A3 木聚糖酶活力单位定义
在37℃，pH 为5.5 的条件下，每分钟从浓度为5mg/mL 的木聚糖溶液中降解释放1umol 还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。 A4 测定原理
木聚糖酶能将木聚糖降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂发生显色反应。反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中木聚糖酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中木聚糖酶的活力。 A5.试剂与溶液
除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682 中规定的三级水。 A5.1 乙酸溶液，c（CH3COOH）为0.1mol/L： 吸取冰乙酸0.60mL。加水溶解，定容至100mL。 A5.2 乙酸钠溶液，c（CH3COONa）为0.1mol/L： 称取无水乙酸钠0.82g。加水溶解，定容至100mL。 A5.3 氢氧化钠溶液，c(NaOH)为200g/L： 称取氢氧化钠20.0g。加水溶解，定容至100mL。
A5.4 乙酸—乙酸钠缓冲溶液，c(CH3COOH—CH3COONa)为0.1mol/L，pH 为5.50
称取无水乙酸钠14g，加入冰乙酸1.70mL。再加水溶解，定容至2000mL。测定溶液的pH。 如果pH 偏离5.50，再用乙酸溶液（5.1）或乙酸钠溶液（5.2）调节至5.50。 A5.5 木糖储备溶液，c(C5H10O5)为10.0mg/mL：
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称取无水木糖1.000g，加缓冲液（5.4）溶解，定容至100mL。 A5.6 木聚糖溶液，浓度为10mg/mL
称取木聚糖（Sigma X4252）1.00g，加入氢氧化钠0.32g(或0.5mol/LNaOH 溶液16mL)，再加入90mL 水（75mL）,加热，磁力搅拌至木聚糖完全溶解。再加入冰乙酸0.5mL，再用乙酸乙酸钠缓冲溶液（5.4）定容至100mL。如果pH 偏离5.50，再用乙酸溶液（5.1）或乙酸钠溶液（5.2）调节pH至5.50，然后再用乙酸乙酸钠缓冲溶液（5.4）定容至100mL。使用前，适当摇匀。4℃避光保存，有效期为12h。 A5.7DNS 试剂
称取3,5-二硝基水杨酸3.15g（化学纯），加水500mL，搅拌5s，水浴至45℃。然后逐步加入100mL氢氧化钠溶液（5.3），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃）。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g 和无水亚硫酸钠2.50g。继续45℃水浴加热，同时补加水300mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000mL。用烧结玻璃过滤器过滤(孔径为0.45μm)。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7天后可以使用，有效期为180d。 A6.仪器与设备
A6.1 分析天平：感量0.001g。 A6.2 pH 计：精确至0.01。
A6.3 恒温水浴锅：温度控制范围在30-60℃之间，精度为0.1℃。 A6.4 分光光度计：能检测350-800nm 的吸光度范围。 A6.5 移液器：精度为μL。 A7. 标准曲线的绘制
A7.1 吸取贮备液（5.5）按下表配制成木糖标准溶液
管号 1
2 3 4 5 6 7
取木糖储备液体积(m L)
1 2 3 4 5 6 7
取乙酸—乙酸钠缓冲液体积(mL)
99 98 97 96 95 94 93
木糖浓度(mg/mL) 0.10
0.20
0.30 0.40 0.50 0.60 0.70
A7.2 吸取乙酸-乙酸钠缓冲液（5.4）4.0mL，加入DNS 试剂（5.7）5.0mL，沸水浴加热5 分钟，用自来水冷却至室温，用水定容至25.0mL，制成标准空白样。
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A7.3 分别吸取上述浓度系列的木糖标准溶液各2.00mL（做两个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入2mL 缓冲液（5.4）和5mLDNS 试剂（5.7）。电磁振荡3s，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25mL。吸取缓冲液（5.4）4.0mL，加入DNS 试剂（5.7）5.0mL，沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，再用水定容至25mL，以标准空白样为对照调零，在540nm 处测定吸光度A 值。
A7.4 以木糖浓度为Y 轴、吸光度A 值为X 轴，绘制标准曲线。新配制或超时的DNS 试剂均需要重新绘制标准曲线。 A8 试样溶液的制备
A8.1 固体样品的反应用酶液制备
称样量称取试样两份，精确至0.0001g。加入40mL乙酸—乙酸钠缓冲溶液（5.4）。磁力搅拌30min，再用缓冲溶液（5.4）定容至100mL，在4℃条件下避光保存1-2h，然后以1000r/min 离心3-5min，取上清液，再用缓冲液（5.4）做适当稀释（稀释后的待测酶液中木聚糖浓度(mg/mL)酶的活力最好能控制在0.04—0.10U/mL 之间）。 A8.2 液体样品的反应用酶液制备
液体样品可以直接用缓冲溶液（5.4）进行稀释、定容（稀释后的酶液中木聚糖的活力最好能控制在0.04—0.10U/mL 之间）。如果稀释后酶液的pH 偏离5.50，需要用乙酸溶液（5.1）或乙酸钠溶液（5.2）调节至5.50，然后再用缓冲溶液（5.4）做适当稀释定容。 A9 测定步骤，按下表操作。
反应顺序
1．加入待测酶液于25mL 比色管中预热10 分钟 2．取10.00mL 底物37℃预热10 分钟 3．加入底物溶液 4．电磁振荡3-5s 5．37℃水解30min 6．加入DNS 终止液 7．电磁振荡3-5s 8．沸水浴5 分钟 9．自来水冷却至室温 10．加水定容至25mL 后摇匀 总体积
取反应液于540nm 波长下以空白为对照测定其吸光度。
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样品管 2.0 mL — 2.0 mL √ √ 5.0mL √ √ √ √ 25.0mL
空白管 2.0 mL — 2.0 mL(第二步)
√ √ 5.0mL(第一步)
√ √ √ √ 25.0mL