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A10. 试样酶活力的计算
XD??(AE?AB)?K?C0??1000?1.5 （1）
M?t式（1）中：
XD — 试样稀释液的木聚糖酶活力，U/mL； AE — 酶反应液的吸光度； AB — 酶空白样的吸光度； K — 标准曲线的斜率； CO — 标准曲线的截距；
M — 木糖摩尔质量，M(C5H10O5)=150.2g/mol； t — 酶解反应时间，min；
1000 — 转化因子，1mmol=1000umol。
1.5—是指底物Sigma(0672)与Sigma(4252)换算系数。
XD 值应在0.04—0.10U/mL 之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。
X?XD?DF (2) m式（2）中：
X — 试样木聚糖酶的活力，U/g或者U/mL； Df — 试样的总稀释倍数。 m— 称样量
酶活力的计算值保留三位有效数字。 A11. 重复性
同一样品两个平行测定值的相对误差不超过5.0%，二者的平均值为最终的酶活力测定值（保留三位有效数字）。
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附录B
β-葡聚糖酶活力的测定
(NY/T911-2004)
B1 应用范围
本标准规定了用分光光度法测定饲料添加剂中β-葡聚糖酶的活力。
本标准适用于饲料添加剂β-葡聚糖酶产品,也适用于添加有β-葡聚糖酶的浓缩饲料和添加剂预混合饲料。样品最低检出量为1.0U/g. B2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注册日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注册日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 B3 β-葡聚糖酶活力单位定义
在37℃、pH 为5.5 的条件下，每分钟从4mg/mLβ-葡聚糖溶液中降解释放1umol 还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U. B4 测定原理
β-葡聚糖酶能将β-葡聚糖降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS 试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中β-葡聚糖酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中β-葡聚糖酶的活力。 B5 试剂与溶液
除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682 中规定的三级水。 B5.1 葡萄糖溶液，c（C6H12O6）为10.0mg/mL： 称取无水葡萄糖1.000g，加水溶解，定容至100mL。 B5.2 乙酸溶液，c（CH3COOH）为0.1mol/L： 吸取冰乙酸0.60mL。加水溶解，定容至100mL。 B5.3 乙酸钠溶液，c（CH3COONa）为0.1mol/L： 称取无水乙酸钠0.82g。加水溶解，定容至100mL。 B5.4 氢氧化钠溶液，c（NaOH）为200g/L： 称取氢氧化钠20.0g。加水溶解，定容至100mL。
B5.5 乙酸—乙酸钠缓冲溶液，c（CH3COOH—CH3COONa）为0.1mol/L,pH 值为5.5：
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称取无水乙酸钠14g，加入冰乙酸1.70mL。再加水溶解，定容至2000mL。测定溶液的pH。 如果pH 偏离5.50，再用乙酸溶液（5.2）或乙酸钠溶液（5.3）调节至5.50。 B5.6 β-葡聚糖溶液：浓度为8mg/mL 。
称取β-葡聚糖0.80g，加入10mL 无水乙醇，润湿β-葡聚糖2 分钟，再加入50mL 乙酸—乙酸钠缓冲溶液（5.5）。磁力搅拌，同时缓慢加热，直至β-葡聚糖完全溶解（注：在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过100mL）。然后停止加热，继续搅拌30min，用乙酸—乙酸钠缓冲溶液（5.5）定容至100mL。β-葡聚糖溶液能立即使用，使用前适当摇匀。4℃避光保存，有效期为3 天。（如冷冻保存，有效期为60 天，使用前在4℃条件下解冻） B5.7 DNS 试剂
称取3，5-二硝基水杨酸3.15g（化学纯），加水500mL，搅拌5s，水浴至45℃。然后逐步加入100mL 氢氧化钠溶液（5.4），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃）。在逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g，苯酚2.50g 和无水亚硫酸钠2.50g。继续45℃水浴加热，同时补加水300mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000mL。用烧结玻璃过滤器过滤(孔径为0.45μm)。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7 天后可以使用，有效期为180d。 B6.仪器与设备
B6.1 分析天平：感量0.0001g。 B6.2 pH 计：精确至0.01。
B6.3 恒温水浴锅：温度控制范围在30—60℃之间，精度为0.1℃。 B6.4 分光光度计：能检测350-800nm 的吸光度范围。 B6.5 移液器：精度为1μL。 B7 标准曲线的绘制
B7.1 吸取贮备液（5.1）按下表配制成葡萄糖标准溶液 管号 1 2 3 4 5 6 7
取葡萄糖糖储备液体积(mL)
1 2 3 4 5 6 7
取乙酸—乙酸钠缓冲液体积(mL)
99 98 97 96 95 94 93
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葡萄糖浓度(mg/mL)
0.10
0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70
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B7.2 吸取乙酸-乙酸钠缓冲液（5.5）4.0mL，加入DNS 试剂（5.7）5.0mL，沸水浴加热5 分钟，用自来水冷却至室温，用水定容至25.0mL，制成标准空白样。
B7.3 分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各2.00mL（做两个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入2mL 缓冲液（5.5）和5mLDNS 试剂（5.7）。电磁振荡3s，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25mL。吸取缓冲液（5.5）4.0mL，加入DNS 试剂（5.7）5.0mL，沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，再用水定容至25mL，以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度A 值。
B7.4 以葡萄糖浓度为Y 轴、吸光度A 值为X 轴，绘制标准曲线。新配制或超时的DNS 试剂均需要重新绘制标准曲线。 B8.试样溶液的制备
B8.1 固体样品的反应用酶液制备
按照附录A 中建议的称样量称取试样两份，精确至0.0001g。加入40mL 乙酸—乙酸钠缓冲溶液（5.4）。磁力搅拌30min，再用缓冲溶液（5.5）定容至100mL，在4℃条件下避光保存1-2h，然后以1000r/min 离心3-5min，取上清液，再用缓冲液（5.5）做适当稀释（稀释后的待测酶液中木聚糖酶的活力最好能控制在0.04—0.08U/mL 之间）。 B8.2 液体样品的反应用酶液制备
液体样品可以直接用缓冲溶液（5.5）进行稀释、定容。如果稀释后酶液的pH 偏离5.50，需要用乙酸溶液（5.2）或乙酸钠溶液（5.3）调节至5.50，然后再用缓冲溶液（5.5）做适当稀释定容。 B9 测定步骤，按下表操作。
反应顺序
1．加入待测酶液于25mL 比色管中预热10 分钟 2．反应底物37℃预热10 分钟 3．加入底物溶液 4．电磁振荡3-5s 5．37℃水解30min 6．加入DNS 终止液 7．电磁振荡3-5s 8．沸水浴5 分钟 9．自来水冷却至室温 10．加水定容至25mL 后摇匀 总体积
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样品管 2.0 mL — 2.0 mL √ √ 5.0mL √ √ √ √ 25.0mL
空白管 2.0 mL — 2.0 mL(第二步)
√ √ 5.0mL(第一步)
√ √ √ √ 25.0mL
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取反应液于540nm 波长下以空白为对照测定其吸光度。 B10 试样酶活力的计算
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M?t式（1）中：
XD — 试样稀释液中的β-葡聚糖酶活力，U/mL； AE — 酶反应液的吸光度； AB — 酶空白样的吸光度； K — 标准曲线的斜率； CO — 标准曲线的截距；
M — 葡萄糖摩尔质量，M(C6H12O6)=180.2g/mol t— 酶解反应时间，min；
1000—转化因子，1mmol=1000umol
XD 值应在0.04—0.08U/mL 之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。
X?XD?DF （2） m式（2）中：
X — 试样β-葡聚糖酶的活力，U/g或者U/mL； Df — 试样的总稀释倍数。 m— 称样量
酶活力的计算值保留三位有效数字。 B11 重复性
同一样品两个平行测定值的相对误差不超过5.0%，二者的平均值为最终的酶活力测定值（保留三位有效数字）。
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