上海欧耐施生物技术有限公司—品控部
附录C
甘露聚糖酶活力的测定
(欧耐施企标）
C1 应用范围
本标准规定了用分光光度法测定饲料添加剂中甘露聚糖酶的活力。 本标准适用于饲料添加剂甘露聚糖酶产品。 C2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注册日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注册日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 C3 甘露聚糖酶活力单位定义
在37℃，pH 为5.5 的条件下，每分钟从浓度为3mg/mL 的甘露聚糖溶液中降解释放1umol 还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。 C4 测定原理
甘露聚糖酶能将甘露聚糖降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂发生显色反应。反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中甘露聚糖酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中甘露聚糖酶的活力。 C5.试剂与溶液
除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682 中规定的三级水。 C5.1 乙酸溶液，c（CH3COOH）为0.1mol/L： 吸取冰乙酸0.60mL。加水溶解，定容至100mL。 C5.2 乙酸钠溶液，c（CH3COONa）为0.1mol/L： 称取无水乙酸钠0.82g。加水溶解，定容至100mL。 C5.3 氢氧化钠溶液，c(NaOH)为200g/L： 称取氢氧化钠20.0g。加水溶解，定容至100mL。
C5.4 乙酸—乙酸钠缓冲溶液，c(CH3COOH—CH3COONa)为0.1mol/L，pH 为5.50
称取无水乙酸钠14g，加入冰乙酸1.70mL。再加水溶解，定容至2000mL。测定溶液的pH。 如果pH 偏离5.50，再用乙酸溶液（5.1）或乙酸钠溶液（5.2）调节至5.50。 C5.5 甘露糖储备溶液，浓度为10.0mg/mL：
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称取无水甘露糖1.000g，加缓冲液（5.4）溶解，定容至100mL。 C5.6 甘露聚糖溶液，浓度为6.0mg/mL
称取甘露聚糖0.60g (Sigma G0753)，加入90mL 水（75mL）,加热，磁力搅拌至甘露聚糖完全溶解。再用乙酸乙酸钠缓冲溶液（5.4）定容至100mL。如果pH 偏离5.50，再用乙酸溶液（5.1）或乙酸钠溶液（5.2）调节pH 至5.50，然后再用乙酸乙酸钠缓冲溶液（5.4）定容至100mL。使用前，适当摇匀。4℃避光保存，有效期为36h。 C5.7 DNS 试剂
称取3,5-二硝基水杨酸3.15g（化学纯），加水500mL，搅拌5s，水浴至45℃。然后逐步加入100mL氢氧化钠溶液（5.3），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃）。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g 和无水亚硫酸钠2.50g。继续45℃水浴加热，同时补加水300mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000mL。用烧结玻璃过滤器（孔径为0.45μm）.过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7天后可以使用，有效期为180d。 C6.仪器与设备
C6.1 分析天平：感量0.001g。 C6.2 pH 计：精确至0.01。
C6.3 恒温水浴锅：温度控制范围在30-60℃之间，精度为0.1℃。 C6.4 分光光度计：能检测350-800nm 的吸光度范围。 C6.5 移液器：精度为μL。 C7 标准曲线的绘制
C7.1 吸取贮备液（A5.5）按下表配制成木糖标准溶液 管号 1 2 3 4 5 6 7
取甘露糖储备液体积(mL)
1 2 3 4 5 6 7
取乙酸—乙酸钠缓冲液体积(mL)
99 98 97 96 95 94 93
甘露糖浓度(mg/mL)
0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70
C7.2 吸取乙酸-乙酸钠缓冲液（5.4）4.0mL，加入DNS 试剂（5.7）5.0mL，沸水浴加热5 分钟，用自来水冷却至室温，用水定容至25.0mL，制成标准空白样。
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C7.3 分别吸取上述浓度系列的甘露糖标准溶液各2.00mL（做两个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入2mL 缓冲液（5.4）和5mLDNS 试剂（5.7）。电磁振荡3s，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25mL。吸取缓冲液（5.4）4.0mL，加入DNS 试剂（5.7）5.0mL，沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，再用水定容至25mL，以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度A 值。
C7.4 以甘露糖浓度为Y 轴、吸光度A 值为X 轴，绘制标准曲线。新配制或超时的DNS 试剂均需要重新绘制标准曲线。 C8 试样溶液的制备
C8.1 固体样品的反应用酶液制备
按照附录A 中建议的称样量称取试样两份，精确至0.0001g。加入40mL 乙酸—乙酸钠缓冲溶液（5.4）。磁力搅拌30min，再用缓冲溶液（5.4）定容至100mL，在4℃条件下避光保存1-2h，然后以1000r/min 离心3-5min，取上清液，再用缓冲液（5.4）做适当稀释（稀释后的待测酶液中甘露聚糖酶的活力最好能控制在0.04—0.08U/mL 之间）。 A8.2 液体样品的反应用酶液制备
液体样品可以直接用缓冲溶液（5.4）进行稀释、定容。如果稀释后酶液的pH 偏离5.50，需要用乙酸溶液（5.1）或乙酸钠溶液（5.2）调节至5.50，然后再用缓冲溶液（5.4）做适当稀释定容。 C9 测定步骤，按下表操作。
反应顺序
1．加入待测酶液于25mL 比色管中预热10 分钟 2．反应底物37℃预热10 分钟 3．加入底物溶液 4．电磁振荡3-5s 5．37℃水解30min 6．加入DNS 终止液 7．电磁振荡3-5s 8．沸水浴5 分钟 9．自来水冷却至室温 10．加水定容至25mL 后摇匀 总体积
取反应液于540nm 波长下以空白为对照测定其吸光度。
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样品管 2.0 mL — 2.0 mL √ √ 5.0mL √ √ √ √ 25.0mL
空白管 2.0 mL — 2.0 mL(第二步)
√ √ 5.0mL(第一步)
√ √ √ √ 25.0mL
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C10. 试样酶活力的计算
XD??(AE?AB)?K?C0??1000 （1）
M?t式（1）中：
XD — 试样稀释液中的甘露聚糖酶活力，U/mL； AE — 酶反应液的吸光度； AB — 酶空白样的吸光度； K — 标准曲线的斜率； CO — 标准曲线的截距；
M — 甘露糖摩尔质量，M(C6H12O6)=180.2g/mol t— 酶解反应时间，min；
1000—转化因子，1mmol=1000umol
XD 值应在0.04—0.08U/mL 之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。
X?XD?DF （2） m式（2）中：
X — 试样甘露聚糖酶的活力，U/g或者U/mL； Df — 试样的总稀释倍数。 m— 称样量
酶活力的计算值保留三位有效数字。 C11. 重复性
同一样品两个平行测定值的相对误差不超过5.0%，二者的平均值为最终的酶活力测定值（保留三位有效数字）。
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附录D
纤维素酶活力的测定 (NY/T912-2004)
D1 应用范围
本标准规定了用分光光度法测定饲料添加剂中纤维素酶的活力。
本标准适用于饲料添加剂纤维素酶产品，含有纤维素酶添加剂预混料，样品最低检出量1.0U/g。 D2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注册日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注册日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 D3 纤维素酶活力单位定义
在37℃，pH 为5.5 的条件下，每分钟从浓度为4mg/mL 的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。 D4 测定原理
纤维素酶在一定温度和PH条件下，将纤维素底物(羧甲基纤维素钠)水解，释放出还原糖。在碱性、煮沸条件下，3,5一二硝基水杨酸(DNS试剂)与还原糖发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖(以葡萄糖计)含量成正比。通过在540 nm测其吸光度，可得到产生还原糖的量，计算出纤维素酶CMCA-DNS酶活力。以此代表纤维素酶的酶活力。 D5.试剂与溶液
除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682 中规定的三级水。 D5.1 乙酸溶液，c（CH3COOH）为0.1mol/L： 吸取冰乙酸0.60mL。加水溶解，定容至100mL。 D5.2 乙酸钠溶液，c（CH3COONa）为0.1mol/L： 称取无水乙酸钠0.82g。加水溶解，定容至100mL。 D5.3 氢氧化钠溶液，c(NaOH)为200g/L： 称取氢氧化钠20.0g。加水溶解，定容至100mL。
D5.4 乙酸—乙酸钠缓冲溶液，c(CH3COOH—CH3COONa)为0.1mol/L，pH 为5.50
称取无水乙酸钠14g，加入冰乙酸1.70mL。再加水溶解，定容至2000mL。测定溶液的pH。如果pH 偏离5.50，再用乙酸溶液（5.1）或乙酸钠溶液（5.2）调节至5.50。
D5.5 葡萄糖储备溶液，c(C5H10O5)为10.0mg/mL：称取无水葡萄糖1.000g，加缓冲液（5.4）溶解，
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