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续表1
吸光度(A) 酶浓度(c)／(u/mL) 吸光度(A) 酶浓度(c)／(u/mL) 吸光度(A) 酶浓度(c)／(u/mL) 0. 718 0. 719 0. 720 0. 721 0. 722 0. 723 0. 724 0. 725 0. 726 0. 727 0. 728 0. 729 0. 730 0. 731 0. 732 0. 733 0. 734
2. 958 2. 957 2. 956 2. 955 2. 953 2. 952 2. 951 2. 95 2. 949 2. 947 2. 946 2. 945 2. 944 2. 943 2. 941 2. 94 2. 939 0. 735 0. 736 0. 737 0. 738 0. 739 0. 740 0. 741 0. 742 0. 743 0. 744 0. 745 0. 746 0. 747 0. 748 0. 749 0. 750 0. 751 2. 938 2. 937 2. 936 2. 935 2. 933 2. 932 2. 931 2. 93 2. 929 2. 928 2. 927 2. 926 2. 925 2. 923 2. 922 2. 921 2. 92 0. 752 0. 753 0. 754 0. 755 0. 756 0. 757 0. 758 0. 759 0. 760 0. 761 0. 762 0. 763 0. 764 0. 765 0. 766 2. 919 2. 918 2. 917 2. 916 2. 915 2. 914 2. 913 2. 912 2. 911 2. 91 2. 909 2. 908 2. 907 2. 906 2. 905 页 第 29
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附录G 蛋白酶活性测定方法 （GB/T23527-2009福林法）
G 1 蛋白酶活力单位定义
1g 固体酶粉(或1mL 液体酶)，在一定温度和pH 值条件下，1min 水解酪蛋白产生1μg 酪氨酸为一个活力单位，以u/g(u/mL)表示。 G2测定原理
蛋白酶在一定温度和pH值条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（FoLin）还原，生成钼蓝和钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力。 G 3 应用范围
本法适用于饲料添加剂酶制剂测定。 G4 仪器设备
G4.1 紫外-可见光分光光度计 G4.2 恒温水浴 精度±0.2℃ G4.3 秒表
G4.4 分析天平：感量0.0001g G4.5 PH计精度为0.01PH单位 G5试剂和溶液 G5.1福林试剂的准备
于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2WO4.2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4.2H2O）25g，水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL，小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（LiSO4）50g，水50mL和数滴浓溴水（99%），再微沸15min，以除去多余的溴（冷却后仍有绿色需要再加入溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，加水定容至1000mL，混匀，过滤。制得得试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。
使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。
G5.2 碳酸钠溶液c(Na2CO3)=0.4 mol/L称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4 g,用水溶解并定容至1000 mL。 G5.3 三氯乙酸c(CCl3·COOH)=0.4 mol/L 称取三氯乙酸65.4 g ，用水溶解并定容至1000 mL。 G5.4 氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.5mol/L 按 GB 601 配制。 G5.5 盐酸溶液c(HCL)=1 mol/L 及0.1 mol/L 按 GB 601 配制。 G5.6 缓冲溶液
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a.磷酸缓冲液(pH=7.5)，适用于中性蛋白酶
称取磷酸氢二钠(Na2HP04·12H2O)6.02 g 和磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)0.5 g，加水溶解并定容至1000 mL。
b.乳酸缓冲液(pH=3.0 ) 适用于酸性蛋白酶(1和2方法都可以）
1)称取乳酸(80%～90%)4.71 g和乳酸钠(70%)0.89g，加水至900mL，搅拌至均匀。用乳酸或者乳酸钠调整PH3±0.05；定容至1000mL。
2)甲液 称取乳酸（80%~90%）10.6g，加水溶解并定容至1000mL。 乙液 称取乳酸钠（70%）16g，加水溶解并定容至1000mL。
使用溶液 取甲液8mL，乙液1mL，混匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。 c.硼酸缓冲溶液(pH= 10.5) 适用于碱性蛋白酶
1)取硼酸钠(硼砂)9.54g和氢氧化钠1.6 g，加水至900mL，搅拌至均匀。用0.1mol/L盐酸溶液和0.05mol/L的氢氧化钠溶液，调整PH=10.5±0.05，定容至1000mL。 2)甲液 称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000mL。
乙液 称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000mL。(1和2方法都可以） 使用溶液 取甲液500 mL、乙液400 mL 混匀，用水稀释至1000 mL, 上述各种缓冲溶液，均须用pH 计校正。
G5.7 L0 g/L 酪蛋白溶液(注:3 酪素（酪蛋白）采用国药试剂和Sigma代替。)
称取标准酪蛋白（NICPBP国家药品标准物质）1.000 g，精确至0.001 g，用少量0.5 mol/L 氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3 滴)湿润后，加人适量的各种适宜pH 的缓冲溶液约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100 mL 容量瓶中，用适宜的pH 缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。 G5.8 100μg/mL L-酪氨酸
a. 称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000 g，精确至0.0002 g，用1mol/L 盐酸60mL 溶解后定容至100 mL，即为1 mg/mL 酪氨酸标准溶液。
b. 吸取 1 mg/mL 酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.L mol/L盐酸定容至100mL，即得到100 μg/mLL-酪氨酸标准溶液。 G6 分析步骤 G6.1 标准曲线的绘制
a)L-酪氨酸标准溶液：按照表G1配制，L-酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测定。
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表G1
酪氨酸标准溶液的浓度/
管号
（μg/mL）
0 1 2 3 4 5
0 10 20 30 40 50
（mL） 0 1 2 3 4 5
10 9 8 7 6 5
取100μg/mL酪氨酸标准溶液的体积/
取水的体积mL
b).分别取上述溶液各1.00mL（须做平行试验），各加0.4mol/L碳酸钠溶液5.0mL，福林试剂使用液1.00mL，置于40℃±0.2℃水浴中显色20min，用分光光度计于波长680nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度，以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度C为横坐标，绘制标准曲线（曲线应通过零点）。
c)利用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），既为吸光度常数K值。其K值应在95~100范围内。如不符合，需重新配置试剂，进行试验。 G7 待测酶液的制备
称取酶粉1～2g，精确至0.0002 g(或吸取液体酶1.00 mL) ，然后用相应的缓冲溶液溶解并稀释到一定浓度，推荐浓度范围为酶活力10U/mL~15U/mL。
对于粉状样品，然后用相应的缓冲溶液充分溶解，然后取滤液（慢速定性滤纸）稀释至适当的浓度。 G8测定步骤，按下表操作
反应顺序
1．加入待测酶液 2．40℃±0.2℃预热2 min 3．反应底物40℃±0.2℃预热3min 4．加入底物溶液 5．混匀
6．40℃±0.2℃水解10min 7．加入三氯乙酸终止液 8．混匀 9．静止10 分钟
10．过滤（慢速定性滤纸） 11．取滤液 12．加碳酸钠溶液
样品管 2.0 mL √ √ 2.0 mL √ √ 4.0 mL √ √ √ 1.0mL 5.0mL
空白管 2.0 mL √ √
2.0 mL （第二步）
√ √
4.0 mL （第一步）
√ √ √ 1.0mL 5.0mL
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13．加福林使用溶液 14．混匀
15．40℃±0.2℃显色20min 取反应液于680nm 波长下以空白为对照测定其吸光度。
1.0mL √ √ 1.0mL √ √ 1.398和166中性蛋白酶，除反应与显色温度为30±0.2℃外，其他操作同5.2，标准曲线也作同样处理。 G9计算
X?A1?V1?4?N11? （1）
m10式 (1) 中：
X—样品的酶活力，u/g(u/mL)；
A1—由标准曲线得出样品最终稀释液的活力，u/mL； V1—溶解样品所使用的容量瓶的体积，单位为毫升（mL)
4—反应试剂的总体积8mL，吸取酶液2.00 mL ，4=8/2，即1mL酶液反应总体积； N1—样品的稀释倍数 ； m—样品的质量，单位为克（g);
1—反应时间为10min,以1min计。 10所得结果表示至整数。 G 10 结果的允许差
平行试验测定值之差不得超过3%。
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