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附录G 蛋白酶活性测定方法
（GB/T23527-2009紫外分光光度法）
G 1测定原理
蛋白酶在一定的温度与pH 条件下，水解酪素酪蛋白生成酪氨酸，然后加人三氯乙酸终止酶反应，并沉淀未水解的酪蛋白，滤液中的酪氨酸对紫外分光光度法在275nm下进行测定。根据吸光度与酶活的比例关系计算其酶活力。
不同的蛋白酶酶制剂对其紫外法结果与福林法结果的换算系数不同。如需要，相关方可根据试验结果统计，确定两个方法的换算系数。 G2 仪器设备 同福林法中G4 G3试剂和溶液 同福林法中G5 G4分析步骤
按福林法表1 配制不同浓度的L-酪氨酸标准溶液，然后，直接用紫外分光光度计测定其吸光度(A)，并计算K 值，(其K 值应在130～135 范围内)，如不符合，需重新配置试剂，进行试验。 G5待测酶液的制备
同福林法G7,样品稀释最终浓度应该在10U/mL~20U/mL范围之内。 G6 测定
操作同福林法G8中的取液、反应、静置沉淀，直至过滤[1~11操作步骤]。滤液用紫外分光光度计，在275nm波长下，测定吸光度。
注：如结果不平行，可以考虑将三氯乙酸的试样溶液返回到水浴中保温30min,然后再测吸光度。 G7计算
计算公式同福林法G9
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附录H
α-半乳糖苷酶活性测定方法
(奕农企标检测方法-Q/321322JSY007-2010）
H1范围
本标准规定了用比色法测定饲料添加剂中α-半乳糖苷酶的活力定义、产品分类、技术要求、试验方法、检验规则、标签、包装、运输、贮存和保质期等内容。
本标准适用于本公司生产、销售的以玉米淀粉为载体的饲料添加剂α-半乳糖苷酶产品，也适用于添加有本公司α-半乳糖苷酶的浓缩饲料和添加剂预混合饲料。样品最低检出量为1.0u/g。
H2.规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用本标准。 H3 α-半乳糖苷酶酶活力单位定义
在pH5.5，温度为37℃条件下，每分钟内从10mmol/L对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖中降解释放1μmol对硝基酚所需要的酶量为一个酶活单位U。 H4 测定原理
α-半乳糖苷酶能将对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖降解成对硝基酚。通过400 nm比色测定释放的对硝基酚的量，可以计算反应液中α-半乳糖苷酶的活力。 H5试剂与溶液
除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均符合GB/T 6682中规定的三级水。 H5.1 0.05 mol/L醋酸钠缓冲液：
A液：称取无水醋酸钠4.2 g定容至1000 mL； B液：冰醋酸3.0 mL定容至1000 mL。 用B液调节A液至pH5.5。 H5.2 0.2 mol/L碳酸钠溶液：
准确称取21.198 g无水碳酸钠，定容至1000 mL。 H5.3 对硝基酚标准溶：(10 mmol/ L)
称取0. 1391 g 对硝基苯酚，精确到0. 001 g，用碳酸钠溶液定容至100 mL，低温保存。
依次移取对硝基苯酚标准贮备液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、7 mL、9 mL，用碳酸钠溶液定容至100 mL，配成浓度为0.1 mmol/ L、0.2 mmol/ L、0.3 mmol/ L、0.4 mmol/ L、0.5 mmol/ L、0.7 mmol/ L、0.9 mmol/ L 的对硝基苯酚标准工作液。
H5.4 底物10 mmol/L对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖溶液：
称取3.031 g 对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖，用醋酸钠缓冲液定容至1000 mL，置棕色试剂瓶于4 ℃以下保存。 H6仪器与设备
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H6.1分析天平：感量为0.001 g。 H6.2 pH计：精确至0.01。 H6.3 离心机：2000 rpm以上。
H6.4恒温水浴锅：温度控制范围在30-60 ℃之间，精度为0.1 ℃。 H6.5分光光度计：能检测350-800 nm的吸光度范围。 H7标准曲线的绘制
吸取1 mL对对硝基酚标准溶液（H5.3）于试管中，加入1 mL醋酸钠缓冲液(H5.1)；对照的空白试管中加入2 mL醋酸钠缓冲液（H5.1）；在所有的试管中加入8 mL碳酸钠溶液(H5.2)，振荡，在400 nm处测定吸光度OD值。以对硝基酚浓度为Y轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。 H8试样溶液的制备
固体试样应粉碎或充分碾碎，然后过60目筛（孔径为0.25 mm）。称取固体样品1 g左右，用80 mL醋酸钠缓冲液浸泡，磁力搅拌30分钟，用醋酸钠缓冲液定容至100 mL，离心取上清液。 液体试样可以直接用醋酸钠缓冲液(3.1)进行稀释和定容。 当酶液的酶活在0.02 U/mL以内，测试结果较准确。 H9测定步骤，按照下表操作
反应顺序
1．加入待测酶液
2．37℃±0.2℃预热10 min 3．反应底物37℃±0.2℃预热10min 4．加入底物溶液 5．混匀
6．37℃±0.2℃水解10min 7．加入碳酸钠终止液 8．混匀 总体积
取反应液于400nm波长下以空白为对照测定其吸光度。 H10试样酶活力的计算
样品管 0.1 mL √ √ 0.1mL √ √ 0.8 mL √ 1mL
空白管 0.1 mL √ √
0.1 mL （第二步）
√ √
0.8 mL （第一步）
√ 1mL
XD??(AE?AB)?K?C0??Dfm?t (1)
式（1）中：
X — 试样α半乳糖甘酶的活力，U/g或U/mL； AE — 酶反应液的吸光度；
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AB — 酶空白样的吸光度； K — 标准曲线的斜率； CO — 标准曲线的截距； Df—试样总稀释倍数 m — 称取酶制剂试样量（g) t— 酶解反应时间，min； H11重复性
同一样品两个平行测定值的相对误差不超过8.0%，二者的平均值为最终的酶活力测定值（保留三位有效数字）。
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附录I
植酸酶活性测定方法 （GB/T18634—2009）
I 1 应用范围
本标准规定了用分光光度法测定饲料添加剂中植酸酶的活力。
本标准适用于饲料添加剂植酸酶产品，也适用于添加有植酸酶的配合饲料。方法最低定量限为0.13U/g。
I 2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注册日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注册日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 I 3 方法原理
植酸酶在一定温度和pH 条件下，水解底物植酸钠，生成正磷酸和肌醇衍生物。在酸性溶液中，能与钒钼酸铵会生成黄色的[(NH4)3PO4NH4VO3·16MoO3]复合物，在波长415nm 下进行比色测定。 I 4 活性单位定义
在温度37℃、pH 值5.50 的条件下，每分钟从浓度为5.0 mmol/L植酸钠溶液中释放1μmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U 表示。 I 5 仪器
I 5.1 恒温水浴锅 37±0.1℃
I 5.2 分光光度计 415nm，1cm 比色皿 I 5.4 离心机 4000r/min I 6 试剂
I 6.1 磷酸二氢钾（KH2PO4） ：基准物。 I 6.2 0.25 mol/L乙酸缓冲液(I)：
c (CH3COONa·3H2O)为0.25mol/L：称取无水乙酸钠20.52g（三水乙酸钠:34.02g）于1000 mL容量瓶中，加入900 mL 水溶解，用冰乙酸调节pH 至5.50±0.01，并用蒸馏水定容至1000mL。室温下存放2个月有效。 I 6.3 乙酸缓冲液(Ⅱ)
c (CH3COONa·3H2O)为0.25mol/L：称取称取无水乙酸钠20.52g （三水乙酸钠：34.02g）， 0.5g 曲拉通X-100(Triton X-100)，0.5g 牛血清白蛋白（BSA）于1000mL 烧杯中，加入900mL 水
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