湖南省肿瘤医院 检验科 Clin Lab.HNZL 标题：脑脊液标本细菌学检验标准操作规程 文件编号：版本号：2 HNZLYY/LAB-SOP-WSW-602 生效日期：2013-07-01 编制人：陈建国 批准人：吴白平 审核人：肖平 修改号：0 发行部门：质量管理小组 页码：第 11 页 共 62 页 参考文献
1 CNAS-GL23《医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用指南》, 2013 2周庭银编著. 临床微生物学诊断与图解. 第二版. 上海: 上海科学技术出版社, 2007 3 叶应妩, 王毓三, 申子瑜主编.全国临床检验操作规程. 第3版 .南京: 东南大学出版社, 2006
4 Murray PR. Manual of Clinical Microbilogy. 9th ed. Washington: ASM Press, 2007 5 ISO15189:2007《医学实验室-质量和能力认可准则》, 2007
湖南省肿瘤医院 检验科 Clin Lab.HNZL 标题：呼吸系统标本细菌学检验标准操作规程 文件编号：版本号：2 HNZLYY/LAB-SOP-WSW-603 生效日期：2013-07-01 编制人：陈建国 批准人：吴白平 审核人：肖平 修改号：0 发行部门：质量管理小组 页码：第 12 页 共 62 页 1. 目的
规范呼吸道标本细菌学标准操作规程，确保检验结果准确可靠。 2. 适用范围
呼吸道标本培养和涂片检查。 3. 标本
3.1 标本类型 痰、咽拭、支气管肺泡灌洗吸出液、支气管冲洗液或刷子、肺穿刺等。 3.2 标本采集
3.2.1 采集时间 以晨痰为好；支气管扩张症患者，清晨起床后进行体位引流，可采集大量痰标本。
3.2.2 自然咳痰法 在留取痰之前，用清水反复漱口，应从气管深部咳出痰，吐入无菌容器内。
3.2.3 气管镜下采集法 在病灶附近用导管吸或用支气管刷直接取得标本。 3.2.4 气管穿刺法 在环甲膜下穿刺抽取痰液，收集标本，适用于厌氧菌培养。 3.2.5 棉拭采集法 用无菌棉拭子轻轻擦拭患者鼻咽部黏膜，留取标本，置无菌试管内送检。
3.3 标本拒收标准
3.3.1 申请单姓名、科别、床号与标本的标签不符。 3.3.2 痰标本呈水样或唾液样。
3.3.2 痰涂片白细胞<10／低倍视野，上皮细胞>25／低倍视野。 3.3.4 标本容器溢漏，无瓶盖。
3.3.5 痰标本留取放置时间太长，超过2h。 3.3.6 未用指定的无菌容器留痰作细菌培养。 3.4 标本保存
采集标本后立即送到实验室，放置时间不应超过2h。 4. 试剂、仪器
4.1 革兰染液、氧化酶试剂、3%触酶、血琼脂平板、巧克力平板、中国蓝平板、相关生化试剂等。
4.2药敏纸片、ATB板条TDR系统鉴定卡及药敏板等，有效期及储存条件参见试剂说明书。
4.3 接种针、接种环、电热灼烧器、显微镜、孵育箱、CO2 培养箱等。 5. 细菌鉴定和药敏质控：参见质量管理。 6. 检验步骤
接收标本后，立即对标本进行编号、登记。
湖南省肿瘤医院 检验科 Clin Lab.HNZL 标题：呼吸系统标本细菌学检验标准操作规程 文件编号：版本号：2 HNZLYY/LAB-SOP-WSW-603 生效日期：2013-07-01 编制人：陈建国 批准人：吴白平 审核人：肖平 修改号：0 发行部门：质量管理小组 页码：第 13 页 共 62 页 6.1 肉眼观察 包括颜色、黏度、有无血丝或脓。
6.2 涂片检查 可以确定标本是否适合做细菌培养，直接涂片镜检，依据低倍镜下观察白细胞和上皮细胞数目多少来评定，见下表5-30。并可初步判定是否有病原菌存在。
表5-30 痰标本镜下分类
分级 A B C
白细胞（个）
>25 >25 <10
上皮细胞（个）
<10 <25 >25
注：A、B两种情况的痰标本适合做培养，C不合格，应重新留标本。
6.2.1 一般细菌涂片 挑取脓性或血性痰液制成薄而均匀的涂片，革兰染色后镜检。 6.2.2 结核分枝杆菌涂片 参见《结核分枝杆菌检验操作规程》。
6.2.3 放线菌及诺卡菌涂片 将痰液用生理盐水洗涤数次，如含血液，则加水溶解红细胞， 然后挑取黄色颗粒或不透明的着色斑点，置载玻片上，覆以盖玻片，轻轻挤压，置高倍镜下观察其结构，如见中央为交织的菌丝，末端呈放线状排列，则揭去盖玻片，干燥后作革兰及萋-尼染色镜检。如查见中间部分的菌丝为革兰阳性，而四周放射的末端为革兰阴性，萋-尼染色为非抗酸性者，可报告为”找到革兰阳性杆菌疑似放线菌”。萋-尼染色弱阳性则报告革兰阳性杆菌疑似诺卡菌。 6.3 分离培养
6.3.1 培养标本的选择 应选择黏液脓痰作涂片，排除不合格标本。
6.3.2 痰标本培养前处理 用无菌盐水将痰洗涤或加入等量的1%胰酶溶液，使痰液均质化后备用。
6.3.3 接种 痰液接种于血琼脂平板、巧克力琼脂平板和中国蓝（或EMB、中国蓝）琼脂平板，置5％～10％CO2 环境中，35℃培养18～24 h。
6.3.4根据菌落及形态特点，作出初步判断，然后按各类细菌特征进行生化鉴定，并同时作药物敏感试验。 7操作流程
湖南省肿瘤医院 检验科 Clin Lab.HNZL 标题：呼吸系统标本细菌学检验标准操作规程 文件编号：版本号：2 HNZLYY/LAB-SOP-WSW-603 生效日期：2013-07-01 编制人：陈建国 批准人：吴白平 审核人：肖平 修改号：0 发行部门：质量管理小组 页码：第 14 页 共 62 页
7. 结果报告
8.1 报告的各细菌种可注明各自所占比例情况，可分为纯培养，大量，中等量，少量。 8.2 未检出致病菌时应报告“正常菌群”。 8. 注意事项
9.1 痰标本一般不可采用肉汤或高选择性培养基进行增菌培养。
9.2草绿色链球菌为口腔和鼻咽部的正常菌群，其毒力很低，但由拔牙等原因造成的局部损伤中侵入血流，可引起亚急性细菌性心内膜炎等感染，故从血液中分离出草绿色链球菌有临床意义。
9.3 咳痰标本不做厌氧菌培养。 9. 临床意义
上呼吸道标本培养生长的细菌是否与疾病有关，需各方面综合分析，排除常居菌后，才可作出正确的判断。下呼吸道的痰液应是无细菌的，而经口腔咳出的痰带有多种上呼吸道的正常寄生菌（如草绿色链球菌）。若从患者痰标本中查见致病菌或条件致病菌，提示可能有呼吸道细菌感染。肺炎链球菌是肺炎最常见的致病菌。儿童细菌性肺炎多为流感嗜血杆菌所致。医院获得性肺炎的常见病原菌是革兰阴性杆菌，主要有肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、沙雷菌属和肠杆菌属细菌等。肺结核由结核分枝杆菌引起的。嗜肺军团菌引起军团菌病，肺部厌氧感染大多是脆弱类杆菌及梭杆菌属的细菌等。疑典型形态细菌所致肺部感染时，常先做痰液和支气管
仪器或手工细菌 鉴定及药敏试验 发出报告 肉眼观察 血琼脂平板、巧克力平板、中国蓝平板5%~10% CO2 35℃培养18～24 h 观察菌落特征 及涂片、染色 消化液或 生理盐水处理 涂片染色 痰或咽拭 湖南省肿瘤医院 检验科 Clin Lab.HNZL 标题：呼吸系统标本细菌学检验标准操作规程 文件编号：版本号：2 HNZLYY/LAB-SOP-WSW-603 生效日期：2013-07-01 编制人：陈建国 批准人：吴白平 审核人：肖平 修改号：0 发行部门：质量管理小组 页码：第 15 页 共 62 页 分泌物涂片、染色镜检（如肺部结核痰液涂片、抗酸染色，镜检找抗酸染色阳性结核分枝杆菌，有助于细菌培养检查。 10. 危急值报告
如查出抗酸杆菌阳性，则应及时向临床报告并作报传染病报告。 参考文献
1 CNAS-GL23《医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用指南》, 2013 2周庭银编著. 临床微生物学诊断与图解. 第二版. 上海: 上海科学技术出版社, 2007 3 叶应妩, 王毓三, 申子瑜主编.全国临床检验操作规程. 第3版 .南京: 东南大学出版社, 2006
4 Murray PR. Manual of Clinical Microbilogy. 9th ed. Washington: ASM Press, 2007 5 ISO15189:2007《医学实验室-质量和能力认可准则》, 2007
操作规程：
1．眼、耳、鼻和咽拭子样本采集：
1.1采集眼、耳、鼻、咽拭子时易被粘膜上的正常菌群污染，应在采集时注意。
1.2采集眼分泌物时，应先用无菌生理盐水冲洗眼部，然后用棉拭子拭干，再以无菌棉拭
子采取分泌物。
1.3若从鼻腔采样本作培养，可用一支无菌棉花拭子（其尖端之棉花必须紧密）直接插入鼻腔，应避免用大而疏松的棉花拭子，因其可能滑落，甚至陷于病人鼻腔中。
1.4若从咽喉采集样本作培养，须在光线充足下，压住舌根采集扁桃体两侧分泌物，以防样本干燥，采集时尽量避免接触舌头和唾液。 2．样本处理：
涂片检查：拭子直接在玻片上涂片，根据临床提示决定涂片的数量。
2.1革兰染色：所观察到的细菌染色性及形态报告结果。咽部或口腔拭子还应注意是否有革兰染色阴性的硫螺旋体和粗大梭形杆菌，确定有否奋森螺旋体和梭形杆菌感染。 2.2疑为白喉感染，除已证实为革兰阳性杆菌处，还须用异染颗粒染色法，镜检异染颗粒。2.3疑有念珠菌感染，可以湿片直接在高倍镜下检查芽生孢子和假菌丝。 2.4麻风分枝杆菌检查：可取鼻粘膜拭子涂片做抗酸染色检查。 3培养步骤：
3.1增菌培养：眼内和内耳拭子可增菌培养。应选用适于需氧和厌氧菌生长的培养基增菌。增菌的拭子应不被正常菌群污染，否则，增菌培养会使致病菌因正常菌群过度生长而抑制，产生错误的假象。