湖南省肿瘤医院 检验科 Clin Lab.HNZL 标题：呼吸系统标本细菌学检验标准操作规程 文件编号：版本号：2 HNZLYY/LAB-SOP-WSW-603 生效日期：2013-07-01 编制人：陈建国 批准人：吴白平 审核人：肖平 修改号：0 发行部门：质量管理小组 页码：第 16 页 共 62 页 3.2分离培养：
3.2.1一般培养：根据这些部位感染细菌的特点，须用血平板和巧克力平板作分离培养,必
要时加选中国蓝琼脂。在CO2环境中培养18—24h，此时长出的肺炎链球菌很大，溶血特征明显，十分容易识别，分离脑膜炎奈瑟菌时，接种血平板和专用巧克力平板，置CO2环境中孵育。其他致病菌经纯培养，ATB全自动鉴定后报告。
3.2.2白喉棒状杆菌培养：血平板，经过夜培养后，当用接种环推移开血平板上菌落后可见菌落下有溶血血环。在亚碲酸盐平板上，白喉棒状杆菌的菌落显黑色。
3.2.3流行性脑膜炎流行季节或流行区，采集凝似患者鼻咽拭子，接种于含抗生素的巧克力
琼脂平板上，置CO2环境下孵育，分离培养脑膜炎奈瑟菌。 4．结果报告方式：
4.1对正常无菌的器官如眼内、内耳标本，可报告检出的细菌及敏感试验结果。
4.2鼻、喉拭子检出病原菌时，可直接报告菌名和生长菌数量(纯培养或占优势)及其药敏试验结果。
4.3鼻咽拭子标本在出报告时，必须报告正常菌群量的多少，致病菌量的多少。用1+-4+表示。例如：正常菌群在平板的二段划线均生长，为2+；致病菌在平板的三段划线均生长，为3+。一般认为，致病菌的量必须大于或等于正常菌群的量，临床上才有意义。 5病原菌：
5.1正常眼部是无菌的。
5.2正常的中耳及鼻窦内是无菌的。健康人的咽峡部有口腔的正常菌群。
5.3耳、鼻、咽部的细菌感染病原菌来源于口腔。口腔中既有需氧菌也有厌氧菌，所以，其周围组织器官的感染不仅考虑是需氧菌，也须检查厌氧菌。中耳炎、鼻窦炎及扁桃腺炎的病原菌分布情况见。
5.4百日咳、白喉患者的咽部可以分离到相应的细菌，同时还可以分离出脑膜炎奈瑟菌。
眼、耳、鼻、喉拭子培养常见病原菌
革兰阳性菌 革兰阴性菌 金黄色葡萄球菌 脑膜炎奈瑟菌 肺炎链球菌 淋病奈瑟菌
湖南省肿瘤医院 检验科 Clin Lab.HNZL 标题：呼吸系统标本细菌学检验标准操作规程 文件编号：版本号：2 HNZLYY/LAB-SOP-WSW-603 生效日期：2013-07-01 编制人：陈建国 批准人：吴白平 审核人：肖平 修改号：0 发行部门：质量管理小组 页码：第 17 页 共 62 页 β溶血性链球菌 嗜血杆菌 白喉棒状杆菌 莫拉菌 念珠菌 卡他布兰汉菌 百日咳杆菌 肠杆菌科 假单胞菌属 产碱杆菌属 6．眼、耳、鼻、喉拭子操作流程：
眼、耳、鼻、喉拭子
涂片 血平板 血平板 肉汤 革兰染色 巧克力 巧克力
中国蓝 35℃过夜
血平板
初步报告结果 CO25％-10％ 中国蓝纯分 35℃过夜 35℃过夜 35℃过夜
纯分 菌种鉴定 药敏试验
报告结果
下呼吸道（痰）培养 1．样本采集：
所采取的痰样本，必须真正能代表肺部之分泌物者，通常清晨时痰液最多，且可能含较多量病原菌，采集步骤如下：
湖南省肿瘤医院 检验科 Clin Lab.HNZL 标题：呼吸系统标本细菌学检验标准操作规程 文件编号：版本号：2 HNZLYY/LAB-SOP-WSW-603 生效日期：2013-07-01 编制人：陈建国 批准人：吴白平 审核人：肖平 修改号：0 发行部门：质量管理小组 页码：第 18 页 共 62 页 1.1以清水或牙刷清洁口腔及牙齿，不可用牙膏。
1.2指导患者从呼吸道深部咳出痰（不可含有唾液），装于无菌容器。若作结核菌培养时，应将标本置于4℃冰箱中保存待种。
1.3痰涂片检查：其一是为确定标本是否适合做细菌培养。采用的方法是直接涂片镜检，用无菌小竹签挑取痰液的脓性或带血部分，置于载玻片中，制成涂片。依据低倍镜下观察白细胞和上皮细胞数目的多少来判定。
白细胞 上皮细胞 A >25 <10 B >25 <25 C <10 >25
A、B两种情况的痰适合做培养，C不适合，应退回重留标本。其二是初步判定是否有病原菌存在。 2．样本处理与检查：
2.1 一般细菌涂片检查：挑选痰液中脓性或带血部分，涂成均匀簿片，行革兰染色，镜检。
根据其细菌形态，排列和染色性，大致可以初步推定菌属（或种）。如镜见排列成葡萄状的革兰阳性球菌，可报告为：“找到革兰阳性球菌，形似葡萄球菌”；如见到瓜子仁形或矛头状的尖端相背、成双排列、具有明显荚膜的革兰阳性球菌时，可报告为：“找到革兰阳性双球菌、形似肺炎链球菌”；如查见短而粗的革兰阴性杆菌，排列多成双且有明显荚膜时，可报告为：“找到革兰阴性杆菌形似肺炎克雷白菌”；如查见不易识别的细菌，则报告为：“找到革兰3性3形细菌”。
2.2 结核分枝杆菌涂片：直接涂片:以接种环取干酪样或脓性部分的痰制成涂片，作抗酸染
色。应查遍整个涂片，根据所见结果报告“找到(或未找到)抗酸性杆菌”。
2.3 厌氧菌涂片检查“涂片染色同一般细菌，镜检时注意有芽胞的革兰阳性杆菌 (可能是
芽胞梭菌属)。如见芽胞位菌体不膨大，排列呈竹节状，要注意炭疽需氧芽胞菌。两端尖的革兰 阴性杆菌(可能是梭杆菌)及革兰阴性无芽胞杆菌，同时痰液有恶臭(可能是拟杆菌属)，可根据细菌形态和染色作出报告，不能直接确定为厌氧菌。
2.4 放线菌及奴卡菌涂片检查：将痰液用生理盐水洗涤数次，如含血液，则加蒸馏水溶解
红细胞，然后挑取黄色颗粒(硫磺颗粒)或不透明的着色斑点，置载玻片上，覆以盖玻片，轻轻挤压，置高倍镜下观察其结构。如见中央为交织的菌丝，其末端较粗杆形呈放线状排列。然后揭去盖玻片，干后作革兰及萋-纳氏染色，镜检。
2.4.1 如查见中间部分的菌丝为革兰阳性，而四周放射的末梢菌丝为革兰阴性，萋-纳氏染色
湖南省肿瘤医院 检验科 Clin Lab.HNZL 标题：呼吸系统标本细菌学检验标准操作规程 文件编号：版本号：2 HNZLYY/LAB-SOP-WSW-603 生效日期：2013-07-01 编制人：陈建国 批准人：吴白平 审核人：肖平 修改号：0 发行部门：质量管理小组 页码：第 19 页 共 62 页 为非抗酸性者，可报告为“找到似放线菌”。
2.4.2 如查见革兰染色反应与放线菌相同，但萋-纳氏染色为弱抗酸性时，可报告为“找到似
奴卡菌”。 3．培养步骤：
3.1 痰培养前的处理：（必要时）
3.1.1 痰的洗净：由于痰含有正常菌群，影响病原菌的检出，采用以下方法以减少正常菌群。
将痰加入含有15-20ml灭菌生理盐水的试管中，剧烈振荡5-10秒，然后用接种环将沉淀于管底的脓痰小片沾出，再放入另一试管内，以同样的方法沾出，再放入另一试管内，以同样的方法反复二次，最后将剩余的脓痰接种在培养基上。
3.1.2 痰均质化：痰均质化法以用胰酶均质化为多见。其方法为向痰液内加等量的pH7.6的
1％胰酶溶液，放置37℃90分钟即能使痰液均质化，而对细菌培养无甚影响，此外，还可选用玻璃研磨。
3.2 选择培养基：下呼吸道的病原菌种类繁多，除一般细菌外，还有结核菌、真菌、厌氧
菌等。所以，除基本分离培养外，还须用特殊培养基和适当的培养环境。一般须用以下几种分离方法。
3.2.1 血平板适用于分离各类细菌，特别是β-溶血性链球菌、葡萄球菌。血平板放CO2或
厌氧环境易于分离肺炎链球菌和β-溶血性链球菌。 3.2.2 巧克力平板于CO2环境下分离嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌。 3.2.3 中国蓝/中国蓝平板分离革兰阴性杆菌。
3.2.4 TTC沙保罗培养基分离念珠菌及其他酵母菌、奴卡菌等。 3.2.5 厌氧血平板置厌氧环境，分离厌氧菌。
3.3 对于直接来自下呼吸道的标本(如灌洗、毛刷、穿刺物等)，应定量或半定量作细菌计
数培养。 4．报告方式：
4.1 痰中的病原菌不少属于条件致病菌，与正常菌群同在，在报告时应作说明。对于条件
致病菌，一般仅当其数量超过正常菌群时才可报告鉴定结果及其敏感试验结果。 4.2 检出致病菌时，除报告该菌的鉴定名称外，还需同时报告正常菌群的情况。 4.3 通常以报告草绿色链球菌和奈瑟菌作为正常菌群存在的指标。报告的各种细菌应该注
明各自所占比例情况，以“+”号表示。 如：草绿色莲球菌+ 奈瑟菌+ 肺炎克雷伯菌2+
湖南省肿瘤医院 检验科 Clin Lab.HNZL 标题：呼吸系统标本细菌学检验标准操作规程 文件编号：版本号：2 HNZLYY/LAB-SOP-WSW-603 生效日期：2013-07-01 编制人：陈建国 批准人：吴白平 审核人：肖平 修改号：0 发行部门：质量管理小组 页码：第 20 页 共 62 页 此报告表明肺炎克雷伯菌在数量上多于正常菌群，诊断为病原菌。未检出致病菌 时，应报告“正常菌群”。 5．下呼吸道病原菌：
5.1 正常人的下呼吸道是无菌的，上呼吸道有正常菌群栖居。因下呼吸道的分泌物须经上
呼吸道排出，常受该处的正常菌群的污染，因此，判断下呼吸道分泌物中是否有病原菌存在，须对上呼吸道的正常菌群有所了解。 上呼吸道栖居正常菌群
α、γ链球菌 棒状杆菌* 微球菌 拟杆菌 奈瑟菌* 梭杆菌 嗜血杆菌* 厌氧球菌 表皮葡萄球菌 注：* 致病菌除外。
5.2 引起下呼吸道感染的常见细菌：
下呼吸道感染常见病原菌 革兰阳性菌 革兰阴性菌 肺炎链球菌 卡他布兰汉菌 A群链球菌 脑膜炎奈瑟菌 金黄色葡萄球菌 流感嗜血杆菌 厌氧球菌 肺炎克雷伯菌 结核分枝杆菌 其他肠杆菌科细菌 白喉棒状杆菌 假单胞菌属细菌 放线菌、奴卡菌 嗜肺军团菌 念珠菌
6．痰及下呼吸道分泌物标本操作流程：
痰液及下呼吸道分泌物 肉眼观察 培养前处理 涂片检查