螺旋引入DNA分子，在ATP供能时酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA。几乎所有天然状态的双链DNA均以负超螺旋的方式存在，特别是进行半保留复制的DNA均以种种拓扑异构体的形式存在。负超螺旋是DNA复制的必需条件，负超螺旋可使DNA双链碱基对打开所需要的能量降低4.1KJ/mol，因而，有利于DNA的双链分开。
真核生物拓扑异构酶：酵母、两栖类动物、昆虫、哺乳动物和植物的Ⅰ拓扑异构酶的特性相似，但与原核的酶有明显差异。Ⅰ型：MW=95kD，单体蛋白，不需ATP。Ⅱ型：MW=150~180kD，均为二聚体，需ATP和Mg2+。
3.2.1.4 引物酶(Primase)
引物酶以单链DNA为模板，利用核糖核苷酸合成RNA（6~10nt）作为DNA合成的引物。
引物的意义在于减少致死突变。DNA合成中最初几个核苷酸正确性远比其后的低。引物RNA随后被降解，从而减少了复制错误。
DNA合成以RNA为引物的实验证据：Reiji 以α–32P–dNTP标记＋未标记NTP为底物。引发合成
后，用稀碱处理。32
P出现在水解产物中（RNA水解），证明RNA为引物。引物酶催化引物RNA分子的合成，但它不同于RNA聚合酶。引物酶对雷米封不敏感，而RNA聚合酶则敏感；引物酶只在复制起点处合成RNA引物而引发DNA的复制，而RNA聚合酶则是启动DNA转录合成RNA从而将遗传信息由DNA传递到RNA。
大肠杆菌的引物酶由一条多肽链组成，MW为60KD（比RNA聚合酶小很多），每个细胞中有50~100个分子，由大肠杆菌的dnaG基因编码。但在单链噬菌体M13 DNA和质粒Co1E1 DNA复制时，引物的合成是由RNA聚合酶催化的。噬菌体T7的Gene4蛋白，T4的Gene41和61蛋白等也具有引物酶的活性和具有大肠杆菌引物酶相似的功能。
3.2.1.5 DNA聚合酶(DNA Polymerase)
DNA聚合酶的性质：①以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为前体催化合成DNA；②需要模板和引物的存在；③不能起始合成新的DNA链；④催化dNTP加到生长中DNA链的3‘-OH末端；⑤催化DNA合成的方向是5‘→3‘。
原核DNA聚合酶：DNA polymerase Ⅰ、DNA polymerase Ⅱ和DNA polymerase Ⅲ
DNA pol的发现：1956年，Kornberg用无细胞E. coli系统证明DNA是模板合成。1957年发现DNApolⅠ。
①大肠杆菌DNA polymerase Ⅰ
1956年Kornberg发现DNA聚合酶，又称Kornberg酶。此酶已经研究清楚且代表了其他DNA聚合酶的基本特点。
酶的性质：DNA polⅠ由一条多肽链组成，约含1000个氨基酸残基，MW为109KD。分子含有一个
二硫键和一个SH基。每个分子中含有一个Zn2+，在DNA聚合反应起着很重要的作用。每个大肠杆菌细胞中含有约400个分子，每个分子37℃下能催化667nt/min掺入正在生长的DNA链。DNA polⅠ可被枯草杆菌蛋白酶裂解成2个片段，大片段MW为76KD，称为Klenow片段，具聚合酶和3‘→5‘外切酶的活性，由两个结构域组成。小片段的MW为34KD，具有5‘→3‘外切酶活性。
Some DNA polymerases have a common structure. DNA PolⅠ在空间结构上近似球体，直径约65Å，在酶的纵轴上有一个约20Å的深沟(cleft)，带有正电荷，是酶的活性中心位置。酶的活性中心位置上至少有6个结合位点：a. 模板DNA结合位点；b. DNA生长链或引物结合位点；c. 引物末端结合位点；d. 脱氧核苷三磷酸结合位点；e. 5‘→3‘外切酶活性位点，用以结合生长链前方的5‘-端脱氧核苷酸并切除之；f. 3‘→5‘外切酶活性位点，用以结合和切除生长链上未配对的3‘-端核苷酸。
酶的功能：a. 聚合作用——在引物的3‘-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNA polⅠ逐个聚合上核苷酸。酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板DNA配对时才有催化作用。dNTP进入结合位点后，可能使酶的构象发生变化，促进3‘-OH与5‘-PO4结合生成磷酸二酯键。b. 3’→5’外切酶活性（校对作用）：3‘→5‘外切酶活性是从3‘→5‘方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。错误核苷酸进入polⅠ的结合位点不能与模板配对，无法改变酶的构象而被3‘→5‘外切酶活性位点所识别并切除。在T4噬菌体突变株中分离得到的T4 DNA聚合酶的3‘→5‘外切酶活性很低，使DNA复制的真实性降低，而易发生突变。具有抗突变能力的T4突变株中的DNA聚合酶的3‘→5‘外切酶活性比野生型高得多，因此，其DNA复制真实性好，变异率低。3’→5’外切酶活性的主要功能是校对作用。维持了DNA复制真实性。c. 5’→3’外切酶活性（切除修复作用）：5‘→3‘外切酶活性是从5‘→3‘方向水解DNA生长链前方的DNA链。它只作用具切口的双螺旋DNA，并在切口以外的配对区切割。5‘→3‘外切酶活性在DNA损伤的修复中可能起着重要作用。对冈崎片段5‘-末端RNA引物的去除依赖此种外切酶活性（每次能切除10nt）。DNApolⅠ聚合酶活性和5’→3’外切酶活性协同作用：双链DNA上的单链切口可激活DNA polⅠ的5‘→3‘外切酶活力，从切口的5‘-端切除旧链，同时从切口开始合成新链，可使DNA链上切口向前推进，产生缺口平移(nick translation)，即没有新DNA合成，只有核苷酸交换。缺口平移可从切口开始合成了一条与被取代的旧链完全相同的新链。如果新掺入的脱氧核苷酸三磷酸为α-32P-dNTP，则重新合成的新链为带有同位素标记的DNA分子，可以用作探针进行分子杂交实验。DNA a. 体内DNA合成速率比纯化的DNA polⅠ催化dNTP掺入速率（667nt/min）高20倍；b. 大肠杆菌的一个突变株中，polⅠ的活力正常，但染色体DNA复制不正常；c. 在一些突变株中，polⅠ的活力只是野生型的1%，但DNA复制却正常，而此突变株对辐射和化学诱变剂却高度敏感。