链直到RNA引物的开始处。引物被DNA pol I切除并补齐因RNA切除后形成的空缺,切口再由连接酶连接起来。G4噬菌体(5577nt)的复制与M13的不同之处在于它不是由RNA聚合酶起始复制,而是由引物酶直接结合到不能结合SSB蛋白的发夹结构上,引物酶合成一段26~29nt,互补于发夹结构一条链的RNA。DNA链在RNA 3‘-OH上延长,此后的反应和M13是相同的。因此,M13的复制能被RNA聚合酶的抑制剂——利福平所抑制,而G4和φX174的复制则不被利福平所抑制。
3.2.2.2 φx174的复制
φX174的复制比M13和G4复杂,需要更多的蛋白质因子参与,形成一个类似大肠杆菌中的复制引发体,并且可能在几个位点起始DNA的合成,可作为冈崎片段合成起始的范例。φx174的复制模式:Φx174的DNA复制除模板外,复制系统均由寄主提供。Φx174(+)链(SS) 合成φx174(-)链,形成RF φx174(SS→RF) RF繁殖(RF→RF) 新的φx174(+)链产生(RF→SS) X174的(-)链合成(SS→RF)
① xl74的(+)链进入寄主细胞,除分子中的发夹结构外,其它部分被SSB覆盖。(-)链合成(SS→RF)需引物体(primosome)参与。在基因F和G间的70nt片段是引物体组装位点(primosome assembly site,pas),pas形成44nt组成的发夹结构可被PriA识别,在PriB和PriC参与下形成复合物。
②由PriA、PriB和PriC组成的复合物与DnaT、DnaB和DnaC组装成预引物体(preprimosome)。其中DnaB和DnaC形成由ATP稳定化的B6C6复合物。预引物体与引物酶(DnaG)结合成引物体。
③引发体在pas位点上形成,但引物合成是在很多位点上,表明引发体可沿着单链DNA引发位点移动。当引物合成后,PriA水解ATP引起DnaB变构而降低与单链DNA的亲和性,移动到另一个起始位点,ADP又被ATP取代,引物酶能稳定DnaB·ATP·ssDNA复合物,开始另一个引发反应。引发体至少含DnaB、PriA和引物酶。PriA可识别pas位点,并且还具有水解ATP和置换SSB的活性,这对引发体移动到其它位点进行引发非常重要。M13和G4仅有一个引发点。
④DNA Pol Ⅲ全酶从引物延伸合成DNA片段。引发体移动的方向同DNA链延长方向相反,这说明双链DNA复制时,随从链合成冈崎片段的情形。当复制叉向前移动时,在引发体前方就形成单链,每一次引发反应以后,引发体就沿着单链向前移动到下一个冈奇片段合成开始的位点。因此,引发物移动的方向同复制叉相同,同随从链DNA合成方向相反。
⑤PolⅠ切除RNA引物填补缺口,连接DNA片段。形成的双链DNA称为RF。
⑥引物体继续与DNA相结合以备参与(+)链的合成。 xl74(-)链合成是不连续的。
X174的(+)链合成(RF→SS)(+)链合成涉及噬菌体编码的gpA和大肠杆菌的Rep。gpA(60kD)对(+)链原点具有专一性的核酸内切酶活力。gpA的功能是引发复制起始。
①gpA借引物体结合于识别位点,专一性切割4305和4306间的磷酸二酯键产生切口。gpA通过其酪氨酸残基与4306位5‘端结合,保存链能。②Rep蛋白结合于gpA处的(-)链。Rep蛋白从(+)链使gpA复合物从(+)链的5‘端开始使双链DNA解链,分离出的(+)链被SSB保护。③polⅢ全酶从(+)链3‘端使DNA链不断延伸,形成环化的滚环结构(looped rolling structure)。而原来的(+)链在复制叉移动时仍与gpA相连,如同逐步被剥离。④复制绕(-)链超过完整一周后产生1个双股复制原点,gpA在此再做专一切割,再与新形成的5‘端共价结合,gpA的第2次切割产生单位长度的 X174 DNA,它的3‘-OH向gpA5‘-P做亲核攻击形成环状分子(+链)。每个gpA分子含2个活性酪氨酸,故可完成相继地切割,并与5‘-端相连。在由 x174感染的中期,每个新合成的(+)链指导(-)链合成从而形成RF。在感染的后期,新合成的(+)链通过噬菌体编码的病毒成熟蛋白和衣壳蛋白(gpB、E、D、F、G和H)形成新的病毒粒子。
φx174(-)链合成为随后链复制模式。可用于研究E. coli随后链的合成机制,不连续合成。φx174(+)链合成为主导链复制模式。可用于研究E. coli主导链的合成机制。连续合成。大肠杆菌基因组是双股环形DNA,其复制是由单一原点(origin)开始的 式复制。origin处形成复制叉,经过先导链的连续复制和滞后链的不连续复制,到达终点完成复制。
3.2.2.3 E. coli DNA复制的引发
E. coli的DNA复制起始指从origin(原点)开始的 起始过程,这一过程不同于随后链上冈崎片段的起始。
DNA复制的引发包括:起始识别→解链→解旋→引发体组装。
复制原点(origin)DNA复制不是随机的从DNA分子上的任何一点起始,而是从特定的区域开始。大肠杆菌的复制起始点(oriC)位于其基因组天冬酰胺合成酶和ATP合成酶操纵子间,oriC包含245bp。
ori的特性
①复制起点几乎都是富含A-T的序列;
已经分离出大肠杆菌染色体DNA复制起点oriC。由245bp的DNA片段组成。oriC含有2个系列的重复单位,其中有3个13bp重复序列和4个9bp重复序列,均富含AT。
②ori在所有细菌复制起始位点中都是保守的
oriC在不同原核生物中有同源性,很多细菌的ori区在结构上相似,在序列上有相当的保守性,且在分类关系上愈接近的细菌间其同源性愈高,表明DNA复制起点的重要性。将一个复制起点连接到任一DNA上,都能支持其复制。9bp(A位点)为DnaA蛋白识别位点。
引发体的形成;复制开始的是形成引发体,这需要