DNA双螺旋结构中的疏水作用力可用加入甲醇（能增加碱基溶解度）或三氟乙酸钠（破坏碱基周围有序的水壳层）来证明。它们对磷酸-脱氧核糖骨架均无明显影响，但能显著降低Tm值，Tm值降低的程度恰恰与碱基溶解度的增加成比例。用旋光色散(ORD)和圆二色性(CD)对单链DNA和RNA进行研究的结果表明，在单股多核苷酸中大部分碱基平行排列使长链成为有规则的螺线(helix)而不是无规则线团(random coil)。甚至在二核苷酸中也发现了碱基平行排列的趋势，在DNA中则更是如此。这些都表明碱基堆积作用的存在。
许多结果都表明，多核苷酸倾向于有一个三维结构以使高度溶解的磷酸基团与水保持最大的接触而把碱基与水的接触减少到最低限度。这就是DNA中磷酸脱氧核糖链在外面而碱基在里面的原因。由于碱基对间氢键的存在，双链DNA中的碱基比单链DNA中的碱些堆集程度更高。当所有碱基指向正确的方向时，可达到最大的氢键键合。同样，若碱基不歪斜或摆动，则能提高碱基堆集作用。并且，已经堆集的碱基更易氢键键合；相应地，已被氢键定向的碱基更容易堆集。
因此，两种作用力相互协同形成稳定的结构。如果一种作用力被消除，则另一种作用力大为削弱。这是为何加入破坏其中一种作用力的试剂会使Tm 值急剧降落。
③带负电荷的磷酸基的静电斥力
DNA链上核苷酸的磷酸基上都带有一个负电荷，双链之间的这种强有力的静电排斥作用将驱使两条链分开。当有盐类存在时这些带负电荷的磷酸基团可被正离子（如Na+）所中和，即正离子在磷酸基周围形成的―离子云‖屏蔽了磷酸基之间的静电斥力。
在生理盐浓度（约0.2mol/L）就可产生这种屏蔽作用。当离子浓度降低时，这种屏蔽作用减弱，斥力增大，因而Tm值随之降低。这也是在纯蒸馏水中的DNA在室温下就会变性的缘故。在超过生理盐浓度时，Tm值仍然随着离子强度的增加而上升，这是因为在高盐浓度下碱基的溶解性降低而增加了疏水作用力，促进了双螺旋结构的稳定。一般制备的DNA也总是DNA的钠盐，每个磷酸基结合一个Na+。
证据：在用NaCl和CsCl测量DNA分子量时，会得到不同的数值，二者之比为0.75。因为单核苷酸的平均分子量为330，若是钠盐则为353，若是铯盐则为467。353/467＝0.75。
④碱基分子内能
当由于温度等因素使碱基分子内能增加时．碱基的定向排列遭受破坏，削弱碱基的氢键结合力和碱基的堆集力，破坏DNA双螺旋结构。因此，影响DNA双螺旋结构状态的因素中， 互补碱基间的氢键和相邻碱基的堆集力有利于DNA维持双螺旋构型，而磷酸基的静电斥力和碱基分子的内能则不利于DNA维持双螺旋构型。一种DNA分子的结构状态是四种因
素竞争的结果。
2.2.1.4 DNA空间结构的不均一性
在DNA的一级结构中A、T、G、C四种碱基并非均匀分布，尽管双螺旋的构型大体相同，但沿着DNA长链各处的空间结构并不完全相同，各处双螺旋的稳定性有所差异，甚至在一定条件下改变了双螺旋的构象，如Z型DNA。即一级结构决定高级结构。
①反向重复序列(inverted repeats )
反复重复序列即回文序列（Palindrome）能在DNA或RNA中形成发夹结构，在DNA中有可能形成十字形结构。这是一个需能过程，一般在DNA水平上发生这种转变的可能性较小。较短的回文结构可能是作为一种特别信号，如限制性内切核酸酶的识别位点。较长的回文序列容易转变为发夹结构，其功能目前还不完全清楚。但人们已经发现，转录的终止作用与回文结构有关。发夹环在tRNA的结构中也很重要，每一种tRNA都是出几个发夹环组成的三叶草形结构。
②富含A／T的序列
在高等生物中，A+T与G+C的含量差不多相等。然而在它们的染色体的某一区域， A.T含量可能很高。例如螃蟹的卫星DNA区段，A－T含量高达97％。它们仅仅重复AT两个碱基，即ATATATATATAT……；大约30个这样碱基才有时插入一个G或C（卫星DNA第九章讲述）。在很多有重要调节功能的DNA区段都富含A-T， 5‘-TA-3‘的Tm值最低，例如在复制起点的序列中，富含A/T序列。启动子中（原核Pribnow框和真核TATA框，即Hogness 框）富含A/T对转录起始复合物形成有重要作用。又例如，生命有机体选择UAA作为最有效的终止密码子是因为在64个三联体密码子中，它与反密码子（假定有的话）形成的互补产物的Tm值是最低的一个，即使在生理温度下也是不稳定的。在三种终止密码子中，UAG和UGA常会为突变型的tRNA无义抑制，而UAA则很少发生无义抑制也可能就是这个道理。这也就说明了为什么在肽链终止处常常会出现双重终止密码子（第六章讲述）。
③嘌呤和嘧啶的排列顺序对双螺旋结构稳定性的影响
考察十种相邻的二核苷酸对(nearest-neighbor doublets)，发现即使碱基组成相同，但嘌呤和嘧啶排列顺序不同，双螺旋的稳定性则有显著差异。碱基间相互作用的强度与相邻碱基间环的重迭面积成正比。总趋势：嘌呤与嘌呤之间>嘌呤与嘧啶之间>嘧啶与嘧啶之间。
Pyrimidine-Purine Steps Have Little Base Stacking Step Definition: Going along one strand of DNA in 5’to 3’ direction
Four Possibles: P-Y, P-P, Y-P, Y-Y
Purine-Pyrimidine Steps Have Extensive Base Stacking
例如5‘-GC-3‘的稳定性比5‘-CG-3‘ 大很多。虽然它们的氢键数目相同，而相邻碱基间的堆积力不同。即从嘌呤到嘧啶的方向的碱基堆集作用显著地大于同样组成的嘧啶到嘌呤方向的碱基推集作用。这是由于嘌呤环和