有160bp长的序列完全相同。T7-DNA复制时,产生的两个子代DNA的3‘-端尾巴以互补结合。再由DNA polⅠ填充和DNA连接酶连接后,形成2个单位长度的T7-DNA分子。这样复制下去,便可形成多个单位长度的T7DNA分子。这样的T7-DNA分子可被特异的内切酶切开,用DNA polⅠ填充,形成与亲代DNA完全一样的双链T7DNA分子。
②痘病毒DNA的复制
痘病毒DNA在两端都形成发夹环状结构。DNA复制时,在线性分子中间的一个复制起点开始,双向进行,将发夹环状结构变成双链环状DNA。在发夹中央将不同DNA链切开,使DNA分子变性,双链分开。在每个分子两端形成单链尾端,再以自我互补,形成完整的发夹结构,与亲代DNA分子一样。
腺病毒(Adenovirus) DNA复制:腺病毒是一种无外壳的双链DNA病毒,基因组长35973bp,两端各有反向重复序列103-162bp,两末端各有50bp为复制起点。腺病毒的基因组以线性的双链DNA形式存在,由蛋白VII和一种mu的小蛋白紧密地环绕在其周围,起到类组蛋白样的作用。蛋白V将这种DNA-蛋白复合物连接起来,并通过蛋白VI与病毒衣壳连接在一起。在两条链的5‘端各以共价键结合着一个DNA末端蛋白(TP)复合物(DNA-TPC)的特化的结构,与腺病毒复制密切相关。腺病毒基因组的两端各有一段的反向末端重复序列(ITR),是复制的起始位点。在腺病毒的成熟病毒DNA分子5‘端共价连接一个55kD的蛋白。在腺病毒DNA复制链上的蛋白是80kD,称为末端蛋白(Terminal protein, TP )它比附着在成熟DNA上的要大。这种80kD蛋白实际上是起始复制的特异蛋白,但在成熟的病毒中,它被切成较小的蛋白保留在病毒中。腺病毒本身编码一个80kD的蛋白,该蛋白和DNA聚合酶形成复合物。 80kD蛋白末端丝氨酸+dCTP→形成Protein-dCMP-OH其游离的3‘-OH为DNA pol延伸反应提供引物。而在模板的5‘末端有一分子量55kD的末端蛋白供80kDa蛋白识别,按CG碱基配对。腺病毒感染细胞的过程:腺病毒纤毛的头节区粘附到细胞表面的特异性受体,病毒纤毛基底部五邻体表面的三肽RGD与细胞表面的αvβ3和αvβ5整合素结合,通过内吞作用将腺病毒内化到细胞中并进入溶酶体。在溶酶体中腺病毒衣壳的构象发生变化,从溶酶体中释放出来。腺病毒颗粒转位到细胞核,通过核孔将DNA释放到细胞核内。病毒基因组进入细胞核,进行转录并启动病毒基因组的复制。腺病毒双链DNA的每条单链的5‘端有TP蛋白结合,TP通过其Ser-OH与DNA 5‘端的dCMP 5‘磷酸间形成磷酸二酯键。腺病毒的DNA复制首先是以5‘端结合有TP的dCMP作为引物,以3‘端的末端反向重复序列为模板,进行链置换合成,置换出的单链分子可以自我退火环化,形成锅柄样环形分子,然后这种环形分子再以相同的机制合成出子代双链DNA分子。 环状DNA的复制的末端终止阶段则不存在问题。环状DNA复制到最后,由DNA拓扑异构酶Ⅱ切开双链DNA,将两个DNA分子分开成为两个完整的与亲代DNA分子一样的子代DNA。
3.2.5 DNA复制的保真机制 在长期的进化中,DNA复制过程形成了一系列保真机制,保证复制准确和遗传稳定。E. coli每复制109~1010nt便出现1个误差。由于E. coli DNA有4.5×106bp,这样每1000个细胞经过1次分裂会产生1个错误核苷酸。
①碱基配对原则
单纯以碱基配对原则维持DNA复制准确性时,误差出现频率为10-4~10-5。
②DNA聚合酶的校对作用
DNApolⅠ有两个结构域:大结构域有直径2nm裂缝,DNA可结合于此而使裂缝关闭,DNA可在裂缝中前后滑动;小结构域含核苷酸结合部位;当新合成DNA中含错配核苷酸时,因双螺旋变形而不能在裂缝中向前滑动,只能后移,3‘→5‘外切酶激活,切除错配核苷酸。
DNA pol的校对作用可将错误的核苷酸切掉,重新加上正确的核苷酸。
每个核苷酸的掺入有两次被选择机会,按碱基配对原则,错误核苷酸掺入机率为10-4~10-5,DNA聚合酶本身的校对作用又可使错误核苷酸掺入的机率为10-4~10-5。
这样每掺入一个核苷酸,发生错误的机会只有10-8
~10-10。
③RNA引物起始复制可减少复制错误
DNA复制开始时形成的短核苷酸序列掺入的核苷酸容易出错,DNA合成起始时及冈崎片段合成开始时都有RNA引物。RNA最终被切除可提高DNA复制的准确性。
真核生物DNA聚合酶无3‘→5‘外切酶活性。因此,可能存在其他校正机制以保证DNA复制的准确性。
④修复系统有多种机制和酶。 3.3 真核生物的DNA复制
3.3.1 研究真核生物DNA复制机制的选材
一般选用结构简单的真核生物如:酵母、四膜虫以及真核病毒为材料。真核病毒DNA复制机制与真核染色体DNA复制相同,如SV40。
3.3.2真核生物的复制子 复制时期在S期。
①多复制起点:真核和原核生物DNA复制的基本特征是相同的,但真核DNA比远比原核DNA大,且大多数真核生物是由多细胞组成的,因此在DNA复制上有所不同。真核生物的每一个染色体皆含有许多个复制子(replicon)。复制叉前进的速度大约只有大肠杆菌的1/10。可能原因是真核生物的DNA与组蛋白构成核小体,对复制叉的前进造成阻碍。人类的复制叉每秒约前进100bp;复制整个基因体需8h。果蝇的复制整个基因体仅需3~4min。