《环境微生物的检测与分析》实验指导
编者：吴方丽 李欧
浙江理工大学生命科学学院
二零一四年十二月 中国 浙江 杭州
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目 录
实验一 土壤微生物拮抗菌的分离与测数 ..................................... 3 实验二 拮抗菌的鉴定与保藏 .............................................. 14 实验三 变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析技术及其在微生物种群多样性研究中的应用 29 附录 各种培养基、试剂的配制 .............................................. 39
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实验一 土壤微生物拮抗菌的分离与测数
一、实验目的
1、熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。 2、初步掌握从土壤中分离微生物和测数的基本方法。 3、了解培养基的配制原理，掌握其配制过程和方法。 4、掌握实验室几种灭菌方法及技术。 5、掌握无菌操作技术。 6、了解平板菌落计数的原理。
7、识别土壤中几大类微生物的菌落特征。
8、学习拮抗作用的试验方法，观察微生物间的拮抗现象及抗生素的抗菌作用。
二、实验原理
自然条件下，微生物常以群落状态存在，这种群落往往是不同种类的微生物的混合体。为了研究某种微生物的特性或者要大量培养和使用某种微生物，必须从这些混杂的微生物群落中获得纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离纯化。
在自然界中，土壤是微生物生活的良好环境，各种微生物混居生活在一起。其中生活的微生物的数量和种类极其丰富，因此土壤是人类开发利用微生物资源的重要基地。土壤中微生物的数量、种类与土壤肥力有关，肥沃的土壤中多，贫瘠的土壤中少。其生理类群则与土壤的其它理化性质，如通气性、pH有关。例如在通气良好的菜园土中，好气性微生物占有绝对优势。本实验以肥沃的菜园土为实验材料分离土壤中的好气性细菌、放线菌和霉菌，并进行数量测定。
分离微生物常用的方法有：稀释涂平板法、稀释混合平板法、划线分离法等。根据不同的实验材料可以采用不同的分离方法。其最终目的是在培养基上出现欲分离的微生物的单个菌落，必要时再对单菌落进行进一步的分离纯化。本实验分离细菌时采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、分离放线菌时采用高氏一号琼脂培养基、分离霉菌时采用马铃薯蔗糖琼脂培养基。
稀释平板计数法是根据微生物在固体培养基上一个活的单细胞繁殖能形成一个菌落这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个活的单细胞。计数时，首先将待
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测样品制成一系列稀释液，再取一定稀释度，一定体积的稀释液接种到平板中，使其均匀分布到平板中的培养基内。经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，根据稀释倍数即可计算出样品中的含菌数。由于此方法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。一般用于某些产品检定，如根瘤菌剂等产品的检定，生物制品检验，土壤中可培养微生物含菌量测定及食品、水源的污染程度的检验等方面。
拮抗作用是微生物之间普遍存在的一种相互关系。它是某些微生物生命活动中产生的一种特异性代谢产物─抗生素，具有抑制或杀死另一些微生物的作用。能产生抗生素的微生物称为抗生菌。
平板对峙法常用于拮抗菌对离体植物病原菌的拮抗作用的测定。其原理是，把抗生菌与供试病原菌同时置于同一培养基平板上，由于抗生菌对病原菌的拮抗作用，抗生菌菌落边缘与病原菌菌落边缘之间会产生一定的抑菌距离。抑菌距离越大，拮抗作用越强。
组织法常用于拮抗菌对活体植物病原菌的拮抗作用的测定，也可用于化合物的活性测定。其原理是把抗生菌所产生的抗菌物质预先接种于即将发病的植物组织上或接种在已发病的植物组织上，由于抗生菌所产生的抗菌物质对病原菌的拮抗作用，病原菌无法致病或延缓病原菌的致病作用。
三、实验材料
1、器材：电子天平、带有玻璃珠的三角瓶、摇床、1mL的无菌吸管、10mL的刻度试管、无菌水、搪瓷缸、玻璃涂棒、牛角匙、pH试纸、封口膜、记号笔、线绳、纱布、培养皿、高压蒸汽灭菌器、称量纸、药匙、试管架、涂布棒、酒精灯、超净工作台、火柴。
2、试剂和材料：无菌牛皮纸袋、无菌铲、标签、打孔器，镊子，牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、 葡萄糖、1mol/L NaOH、1mol/LHCl、75%酒精、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、蒸馏水、新鲜马铃薯、10%酚酞、乳酸。
四、实验步骤
（一）培养基的配制
（1）配制牛肉膏蛋白胨（NA）培养基
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普遍的细菌基础培养基。
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配方如下：牛肉膏 3 g 蛋白胨 10g NaCl 5g 琼脂 15-20g 水 1000 mL pH 7.4-7.6
1、称量药品
按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入搪瓷缸中。牛肉膏和蛋白胨可分别放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入搪瓷缸。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。
2、加热溶解
在搪瓷缸中加入少量少于所需的水量，然后放入锅中，在电磁炉上小火加热，并用玻璃棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则需先调pH值后再溶解琼脂，在此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补充所失水分。
3、调pH
用pH试纸或酸碱度计检测培养基的pH值，若pH偏酸，可滴加1mol/L NaoH，边加边搅拌，并随时检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用1 mol/l HCL进行调节。 pH调节通常放在加琼脂之前。注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。
4、过滤
液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。 5、分装
按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。分装量：固体培养基约至试管高度的 1/5；分装入三角瓶内的以不超过其容积的一半为宜，半固体培养基以试管高度的1/3为宜。
6、加棉塞
试管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脱脂棉）制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要适合，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长3/5塞入试管口或瓶口内，以防止棉花脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽、塑料塞或封口膜代替棉塞。
7、包扎
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