2×Ligation buffer
pGEM-T easy Vector（60ng/μL）
T4 DNA Ligase(5 U/μL)
PCR回收产物
Total
4 μL 0.5 μL 0.5 μL 3 μL 8 μL
将以上反应体系混匀后离心2-3 sec，于4℃冰箱放置12-20 hr进行连接。 （2）连接产物的转化
将以上8 μL连接产物全部转化入感受态细胞，具体步骤如下：
a）从-80℃冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞，室温解冻立即放置于冰上。 b）将8 μL连接产物全部加入到200 μL感受态细胞中，轻轻倾斜着转动离心管10圈左右，在冰上放置20-30 min。
c）42℃水浴热击60 sec，迅速拿出平稳地置于冰上3 min，期间勿晃动。 d）加入不含Amp的液体LB培养基600 μL，在掌心平衡至37℃，于37℃，200 rpm摇床振荡培养2 hr（在加液体LB培养基时，需在冰上及超净工作台内操作）。
e）震荡培养结束后，5000 rpm离心1 min，在超净工作台内，将离心管内的上清吸去600 μL，剩下的200 μL轻轻吹打均匀并全部加入到含Amp、IPTG、X-gal的LB固体培养基上，使用无菌的玻璃涂布棒将200 μL混合液轻轻均匀涂开，37℃生化培养箱放置30 min后倒置培养过夜（12 hr-14 hr）。（涂板前将含Amp、IPTG、X-gal的LB固体培养基平衡至室温）。
f）根据蓝白斑筛选原理，挑取培养基上的白斑，接种于3 mL含有Amp 的液体LB培养基中，在37℃，200 rpm 摇床震荡培养12 -14 hr。
（3）重组质粒的提取
采用改进的碱法提取重组大肠杆菌质粒，方法如下：
a）在超净工作台内，将培养12-14 hr的菌液取1 mL于无菌离心管中，并保存两份（一份用于提取重组质粒，一份用于送样测序）。
b）4℃，5500 rpm离心1 min，弃去上清，加入600 TE μL洗涤菌体2-3次。 c）加入100 μL Solution I溶液，涡旋振荡，使菌体悬浮。
d）加入200 μL SolutionⅡ溶液（宜现配现用），快速温和颠倒混匀至澄清，在冰上放置2-5 min。
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e）加入150 μL预冷的SolutionⅢ溶液，温和颠倒数次混匀，有白色絮状沉淀产生，在冰上放置5 min后，4℃、13000 rpm离心15 min。
f）吸取上清液400 μL，加入等体积的异丙醇（或二倍体积的无水乙醇），室温沉淀40 min（或室温沉淀10-15 min），4℃、12000 rpm离心10 min。
g）弃去上清液，加入500 μL 75%的乙醇洗涤沉淀两次，4℃、12000 rpm离心1 min。 h） 真空干燥10-15 min。
i）加入30-35 μL的RTE溶液（0.1% RNase A酶，10 mmol·L-1 Tris·Cl，4 mmol·L-1EDTA）溶解沉淀，37℃水浴反应30 min；
j） 取5 μL重组质粒样品，1%琼脂糖凝胶电泳检测。 （4）重组质粒的鉴定
根据以上电泳检测的结果，选取提取质粒的质量较好的进行酶切，酶切反应体系如下表：
10×Buffer EcoRⅠ EcoRⅠ（10 U/μL）
Plasmid dd H2O Total
2 μL 1 μL 9 μL 8 μL 20 μL
加完试剂离心2-3 sec，37℃水浴酶切反应2 hr，将20 μL酶切反应液加样到1%琼脂糖凝胶，进行电泳检测。
（5）测序
将DGGE电泳条带的克隆产物送上海桑尼生物科技有限公司进行测序。测序所得结果用DNAStar软件和MEGA4.0软件进行序列分析，并在NCBI网站上进行BLAST比对，确定近缘株细菌的种属特征。
（五）种群多样性分析
根据DGGE电泳条带的数量以及条带的亮度评估植物内生菌的多样性及优势种群，采用辛普森指数（Simpson's diversity index）初步分析内生细菌的生物多样性，辛普森指数是一种快速简便较为准确的能评估生物多样性的有效方法。其公式如下：D=1-∑(Ni(Ni-1))/(N(N-1))，其中Ni为群落中第i种的个体数，N为群落中所有种的个体数。
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六、注意事项
1、在混合和灌胶时应避免产生气泡；
2、有时聚丙烯酰胺凝胶的左侧会出现缩水现象以致在胶的顶部到底部之间会产生空气通道，可用2%熔化的琼脂糖凝胶将其充满；
3、所有溶液应保存于4℃棕色瓶中，一般几个月到一年内有效；
4、电泳时凝胶温度必须保持恒定，把胶板浸没于充分搅拌的温控缓冲液槽内。对于缺乏变性剂时比较容易变性的DNA 来说，槽内的温度选择在60℃稍微超过熔点，并且大部分的工作都在60℃下进行(但温度稍高或低一点都可采用)。温度保持恒定可将电泳缓冲液加热到60℃，并把胶浸入其中进行电泳即可；
5、该实验中提取DNA，以及DGGE操作中接触到得很多药品都有毒，还有致癌、变性等毒害，一定要严格操作，做好防护保护自己；
七、结果分析
1、根据DGGE电泳条带的数量结合辛普森指数评估样品内生菌的丰富度和群落结构，条带数量越多以及辛普森指数值越高说明样品内生菌多样性较丰富。
2、根据电泳条带的亮度强弱推断样品中的优势菌群，电泳条带亮度越强说明该种类内生菌在植物体内的数量越多，为植物的优势菌群。
八、思考题
1、如何确证你所提取的植物基因组DNA的完整性？ 2、PCR扩增效果对DGGE分析的影响？
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附录 各种培养基、试剂的配制
1.培养基
牛肉膏蛋白胨培养基（营养琼脂）
蛋白胨 10g 牛肉膏 3g 氯化钠 5g 琼脂 15~20g 1000mL
制法：将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，加入15%氢氧化钠溶液约2ML，校正PH7.2—7.4，加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化。分装在三角锥瓶中，在121℃下高压灭菌20分钟。 高氏一号培养基
可溶性淀粉20g KNO3 1g NaCl 0.5g K2HPO4 FeSO4·7H2O 0.01 g 琼脂20g 水1000mL pH7.4~7.6
先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分到100ml，调pH，121℃灭菌20min。 马铃薯培养基(PDA)
马铃薯（去皮）200g 葡萄糖（或蔗糖）20g 琼脂 15~25g 水 1000ml 自然pH 将去皮的马铃薯切片后放入锅中，然后加少许少于所需的水量在电磁炉上加热20 min，然后用双层砂布过滤，滤液重新放入锅中煮沸，然后加入称量好的蔗糖和琼脂，待各成分溶解后，补充水分至所需体积。 糖发酵实验培养基
蛋白胨 10g NaCl 2g 糖 10 蒸馏水 1000ml pH 7.6 加入1%溴百里酚蓝（溴麝香草酚蓝）水溶液5ml，分子并于试管中倒置一小套管，用以收集细菌产生的气体 1%溴百里酚蓝水溶液 先用少量95%乙醇溶解，再用水配成1%的水溶液 2.染色液、指示剂等
齐氏（Ziehl）石炭酸品红染液
甲液 取石炭酸5克，溶解在95毫升蒸馏水中。
乙液 取0.3克碱性品红，放入研钵中研磨，逐渐加入10毫升95%酒精，继续淹没，使它溶解。
将甲液和乙液混合后，摇匀，过滤，装瓶，备用。
0.5g MgSO4·7H2O 0.5g
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罗氏（Loeffler's）美蓝染液
甲液 取5克美蓝，溶于100毫升95%酒精中，制成美蓝-酒精饱和液。
乙液 取氢氧化钾0.01克（或1%氢氧化钾溶液1毫升），溶液也可用于放线菌染色，0.1%浓度可用于酵母菌染色。 革兰氏（Gram's）染液
用此液染色因先用甲液染色，再加乙液固定，用丙液处理，最后用丁液复染。四种液体的配方如下： 甲液（结晶紫液）
（1）结晶紫 2克 95%酒精 20毫升 （2）草酸铵 0.8克 蒸馏水 80毫升
使用钱江（1）、（2）液相混，静置48小时后使用。 乙液(碘液)
碘 1克 碘化钾 2克 蒸馏水 300毫升
将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘，待碘全部溶解后，加水稀释至300毫升。 丙液 95%酒精溶液 丁液（番红花红液）
2.5%番红花红酒精溶液 10毫升 蒸馏水 100毫升 芽孢染液
用此配方染色是用甲液染色后，用乙液复染。
甲液 取5克孔雀绿，加入少量蒸馏水，使它溶解后，用蒸馏水稀释到100毫升，即成孔雀绿染液。
乙液 取番红花红0.5克，加入少量蒸馏水，使它溶解后，用蒸馏水稀释到100毫升，集成番红花红复染液。 鞭毛染液
——硝酸银染色法
A液：单宁酸5.0g，FeCl3 1.5g，福尔马林(15%) 2.0mL，1%NaOH 1.0mL，蒸馏水100mL。 B液：AgNO3 2.0g,蒸馏水100mL乙液
乳酸石炭酸棉蓝染色液(用于真菌固定和染色)
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石炭酸(结晶酚)20g，乳酸20mL，甘油40mL，棉蓝0.05g，蒸馏水20mL。将棉蓝溶于蒸馏水中，再加入其他成分，微加热使其溶解，冷却后用。滴少量染液于真菌涂片上，加上盖玻片即可观察。霉菌菌丝和孢子均可染成蓝色。染色后的标本可用树脂封固，能长期保存。 中性红指示剂
中性红0.04 g 95%乙醇28 ml 蒸馏水72 ml
中性红pH6.8-8，颜色由红变黄，常用浓度为0.04%。 淀粉水解试验用碘液（卢戈氏碘液） 碘片1 g 碘化钾2 g 蒸馏水300 ml
先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘溶后，加足水分即成。 溴甲酚紫指示剂
溴甲酚紫0.04 g 0.01 mol/L NaOH 7.4 ml 蒸馏水92.6 ml 溴甲酚紫pH5.2~6.8，颜色由黄变紫，常用浓度为0.04%。 溴麝香草酚蓝指示剂
溴麝香草酚蓝0.04 g 0.01 mol/L NaOH 6.4 ml 蒸馏水93.6 ml 溴麝香草酚蓝pH6.0~7.6，颜色由黄变蓝，常用浓度为0.04%。 甲基红试剂
甲基红（Methylred）0.04 g 95%酒精60 ml 蒸馏水40 ml 先将甲基红溶于95%酒精中，然后加入蒸馏水即可。 V.P.试剂
5%α-萘酚无水酒精溶液 α-萘酚5 g 无水乙醇100 ml 40%KOH溶液
KOH 40 g蒸馏水定容至100 ml 吲哚试剂
对二甲基氨基苯甲醛2 g 95%乙醇190 ml 浓盐酸40 ml
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