4.1 g NaCl称溶解在80 mL水中，再缓慢加入10 g 的CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热65℃溶解搅拌，定容至1000 mL。
（2）50×TAE 缓冲液
121 g Tris，18.6 g EDTA，量取28.6 mL冰醋酸，加水至500 mL，pH 8.5。 （3）10% APS（过硫酸铵贮存液）
10 mL 配制：1g 过硫酸铵加水至10mL 。 （4）TEMED(N，N，N＇，N＇，—四甲基乙二胺) 10% APS：TEMED = 4.5：1
（5）变性剂贮存液(0%)：6%丙烯酰胺
100 mL 溶液：15 mL 40% Arc/Bis，2 mL50×TAE 缓冲液，加水至100 mL。 （6）变性剂贮存液(100%)：6%丙烯酰胺
15 mL 40% Arc/Bis；2 mL 50×TAE 缓冲液；40 mL去离子甲酰胺；42 g尿素，加水至100 mL。
（7）溴化乙锭EB溶液
50mg溴化乙锭溶于100ml双蒸水，工作浓度为0.5μg/ml，避光保存。 （8）固定液1
50 mL无水乙醇加入去离子水至500 mL。 （9）固定液2
5 mL硝酸加入去离子水至500 mL。 （10）0.12%银染试剂
0.18g AgNO3加入去离子水至150 mL，同时加入110 μL 37%-40%的甲醛混匀即可，需新鲜配制。
（11）显色液
4.5g Na2CO3加入去离子水至150 mL，需新鲜配制，4℃冰箱保存备用，用前加入75 μL甲醛构成显影液。
（12）终止液
15 mL冰乙酸加入去离子水至500 mL。 4、PCR扩增引物
第一轮PCR引物：fM1: 5’-CCGCGTGNRBGAHGAAGGYYYT-3’ 和rC5:
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5’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’
f515-GC:
5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGCACGGGGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’ 和rC5: 5’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’
四、实验步骤
（一）样品采集及预处理
采集生长健壮的植株并及时处理样品，先用流水将植株表面的基质冲洗干净，用吸水纸把植株表面的水分吸干，样品的根、茎、叶2 g（用于提取总基因组），进行标记。在超净工作台内，首先用无菌水清洗两次，每次约1 min；再用70-75%（V/V）的酒精进行消毒处理20 sec，用3% NaClO消毒液浸泡2 min，最后用无菌水清洗三次，放进无菌瓶中备用。
（二）基因组提取及PCR扩增 1、总基因组的提取
采用改良的CTAB法提取植物样品的总基因组DNA，方法如下：
（1）将预处理后的2 g样品在无菌研钵内用液氮充分研磨至细粉末状，称取0.2 g样品装入1.5 ml 无菌的eppendorf管中。
（2）加入1 mL CTAB提取液（65℃预热），立即混匀，65℃水浴90 min，每间隔20-30 min轻轻颠倒eppendorf管混匀一次，12000 rpm 4℃离心10 min。
（3）取上清，加2/3体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），颠倒数次充分混匀，12000 rpm，4℃，离心10 min，如此重复至上层变澄清。
（4）取上清，加2/3体积的氯仿/异戊醇（24：1），颠倒数次充分混匀，12000 rpm，4℃离心10 min。
（5）取上清，加1/10体积的NaAC溶液和1个体积的无水乙醇（-20℃预冷），在-20℃下沉淀30 min以上，8000 rpm离心5 min。
（6）弃上清，用70%酒精洗涤沉淀2次，8000 rpm离心5 min，真空干燥15 min。 （7）加50 μL TE溶液或ddH2O溶解DNA，取5 μL 上样，1%琼脂糖凝胶电泳检测，-20℃保存。
2、16srDNA基因序列的PCR扩增
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巢式PCR（Nested PCR）是使用两对PCR引物扩增目的DNA片段，第二对引物称为巢式引物，扩增的目的片段包含在第一次PCR扩增片段的内部，保证第二次PCR产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增。因为第二对引物要用于DGGE电泳分析，根据DGGE电泳的原理，上游引物的5’端加上一段40 bp 左右的GC碱基序列（5’-CGCCC GCCGC GCGCG GCGGG CGGGG CGGGG GCACG GGGGG-3’）。
巢式PCR第一次PCR以总基因组为模板，扩增出内生菌的目的基因片段，第二次PCR以第一次PCR产物为模板，并且退火温度较高。
反应体系如下：
10×PCR Buffer dNTP Mixture(10 mM) Primer1 (10 pmol/μL) Primer2 (10 pmol/μL) DNA模板 Taq （5 U/μL） ddH2O Total
反应条件为：
94℃ 794℃ 50℃ 72℃ 2℃
4min 1min 1min 1min 8min
2.5 μL 0.5 μL 1.0 μL 1.0 μL 1.0 μL 0.2 μL 18.8 μL 25 μL 30cycles 33
8℃ ∞
（三）DGGE电泳
采用Decode Universal Mutation Detection System（Bio-Rad，USA）对PCR扩增产物进行电泳分离。具体步骤如下：
1、胶槽的组装
先用95%乙醇清洗两块玻璃板及两个间隔条，再用蒸馏水清洗一遍，干燥。将间隔条置于大玻璃板两侧边缘并且缺口处放在内侧，再将小玻璃板放在上面并与之对齐，用夹子将两块玻璃板固定，并调水平及垂直平衡。
2、DGGE胶的制做
采用6%丙烯酰胺凝胶，根据不同目的片段的大小将0%和100%的变性剂按照相应的比例配置不同的高浓度和低浓度的变性缓冲液，分别取高浓度和低浓度的变性剂溶液20 mL，加90 μL的 4.5 μL/mL 10% APS和20 μL的lμL/mL的TEMED（APS：TEMED =4.5:1），立即颠倒混合均匀。将高浓度变性剂溶液和低浓度变性剂溶液分别吸入相应的针筒，并固定在梯度形成器对应的高低浓度两侧，将出胶针头置于胶板之间。推动梯度形成器，将胶灌入两个玻璃板之间，注意避免产生气泡。灌胶结束后，在胶板顶部小心倾斜插入梳子(避免产生气泡)，静置1.5-2 hr待胶凝固。及时将针筒中剩余的溶液排净并清洗干净。
3、电泳
在DGGE电泳槽中加入7L新鲜配置的1×TAE缓冲液，使电泳槽中的缓冲液页面至“Full”和“Run”中间的位置，将胶板固定在黄色的凝胶板架上，放进电泳槽中，最后将温度控制器盖在电泳槽上。接通电源，打开电泳仪预热使缓冲液的温度达到60℃。轻轻将梳子拔出，将加样孔中的缓冲液用加样针吸出，缓缓加入约30 μL 第二次PCR产物与6×Loading Buffer的混合液，100V电压电泳12 hr。
4、染色
DNA染色采用银染试剂盒进行银染，具体过程包括以下步骤：
a) 固定1：将凝胶加入固定液1，轻轻摇动孵育10 min，小心弃掉液体； b) 固定2：加入固定液2，轻轻摇动孵育3 min，小心弃掉液体； c）用去离子水漂洗三次，每次5 min；
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d）银染：加入0.12%银染试剂暗处孵育20 min，弃液； e）去离子水冲洗两次，每次2 min，充分倒掉去离子水； f）显色：加入显色液，轻轻摇动孵育5-20 min，进行显色；
g）终止反应：当显色步骤中凝胶条带清晰时，立即倒掉显色液，加入入终止液。 5、拍照
快速银染后，进行DGGE凝胶图片的拍照。 （四）条带回收、纯化与测序 1、DGGE条带的回收与纯化
将DGGE条带割胶之后，采用DGGE条带回收试剂盒（溶液法）进行回收，步骤如下：
（1）切下的胶条放入1.5 mL离心管，加入1 mL去离子水上下混匀，离心，用枪头小心将离心管内的水吸取出；重复此步骤一次。
（2）加入1 mL DGGE回收专用的Buffer，颠倒混匀，离心，弃去。
（3）再加入 150 μL DGGE回收专用的Buffer，采用无菌研磨棒将凝胶充分研磨；然后50℃水浴2 hr，期间上下颠倒混匀。
（4）4℃，12000 rpm离心8 min，用移液器小心轻轻吸取上清的 80%至新的1.5 mL离心管，注意不要吸取到离心管底部的沉淀。
（5）计算上清液体体积，加入1/10V NaAc和10 μL 糖原（RNase & DNase-Free），以及加入2.5V预冷的无水乙醇，-80℃冰箱放置1hr或-20℃放置过夜。
（6）4℃，12000 rpm离心15 min，弃去上清；然后加入1 mL -20℃预冷的75 %乙醇，并且上下轻轻颠倒混匀5次。
（7）4℃，12000 rpm离心8 min，弃去上清，倒扣在吸水纸上，然后用2-10 μL枪头小心吸去残余酒精，真空干燥15 min。
（8） 加入10 μL 无菌TE洗脱液，混匀，-20℃保存备用。 2、克隆及测序
以上述获得的DGGE割胶回收产物为模板，采用不含GC夹的巢式引物进行PCR，按照AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒的操作步骤回收目的条带。
（1）PCR产物的连接
将以上回收产物与克隆载体连接，连接反应体系如下：
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