（一）菌落形态（群体形态）的观察
观察不同细菌、放线菌、真菌生成菌落的形态特点。观察内容主要有菌落大小、形状、表面、质地和颜色等方面。其中，菌落的大小可量取其直径；形状指圆形或不规则形等；表面指凸起或平展、有无光泽以及是否光滑等；质地指粘、脆而言，可用接种针挑取菌落，试验是否容易挑取。
（二）细胞形态（个体形态）观察 1、细菌细胞形态观察
（1）区别革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、有无鞭毛和糖被； （2）观察细菌的形状（如球形、杆形、螺旋形等）； （3）菌体排列方式。 革兰氏染色步骤： （1） 涂片
取灭过菌的载玻片于实验台上，用移液枪吸取10ul待检样品滴在载玻片的中央， 用烧红冷却后的接种环将液滴涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。
（2） 干燥
将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水 分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。
（3） 固定：
固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回 通过2-3次，共约2-3秒种，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃），放置待冷后，进行染色。
（4） 初染
加草酸铵结晶紫染色液一滴，染色约1 min，水洗。水洗时用木炭夹夹住载玻片的一端，斜置载玻片，用细小的缓水流自标本的上端流下，洗去多余的染料，勿使水流直接冲洗涂菌处，直到流下的水为无色为止。将标本置于桌上风干，也可用吸水纸轻轻地吸去水份，或微微加热，以加快干燥速度。
（5） 媒染
滴加碘液冲去残水，复染约1 min，水洗。
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（6） 脱色
将载玻片上的水用吸水纸轻轻地吸干净，用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20~30 s，立即用水冲净酒精。
复染
用番红染色液染2~3 min，水洗，干燥。 （7） 镜检
干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。
鞭毛染色步骤：
鞭毛染色——硝酸银染色法 硝酸银染色液配制如下：
A液：单宁酸5.0g，FeCl3 1.5g，福尔马林(15%) 2.0mL，1%NaOH 1.0mL，蒸馏水100mL。
B液：AgNO3 2.0g,蒸馏水100mL。 （1） 载玻片准备：
将载玻片用洗衣粉洗涤后，置于95%的乙醇溶液中浸泡20min，使用时取出再火焰上烧去乙醇及可能残留的油迹。
（2） 制片：
取一块载玻片，在一端滴一滴蒸馏水，用接种环无菌操作从斜面上挑取菌种在载玻片液滴上轻轻蘸一下，使液滴表面形成一薄层菌膜，随后倾斜玻片，使悬菌液缓慢流向另一端，用吸水纸在载玻片边缘处吸去多余菌悬液，自然干燥。
（3） 染色：
滴加硝酸银染液A液覆盖菌面3-5min后用蒸馏水充分洗去A液，之后用B液洗去残留水分，再滴加B液覆盖菌面数秒至1min，其间可用微火加热，当菌面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗，自然干燥。
（4） 镜检：
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先低倍，再高倍，最后用油镜检查，菌体呈深褐色，鞭毛呈浅褐色。 荚膜染色步骤：
推荐以下四种染色法，其中以湿墨水方法较简便，并且适用于各种有荚膜的细菌。如用相差显微镜检查则效果更佳。
负染色法：
（1）制片：取洁净的载玻片一块，加蒸馏水一滴，取少量菌体放入水滴中混匀并涂布。
（2）干燥：将涂片放在空气中晾干或用电吹风冷风吹干。 （3）染色：在涂面上加复红染色液染色2—3min。 （4）水洗：用水洗去复红染液。
（5）干燥：将染色片放空气中晾干或用电吹风冷风吹干。
（6）涂黑素：在染色涂面左边加一小滴黑素，用一边缘光滑的载玻片轻轻接触黑素，使黑素沿玻片边缘散开，然后向右一拖，使黑素在染色涂面上成为一薄层，并迅速风干。
（7）镜检：先低倍镜，再高倍镜观察。 结果：背影灰色，菌体红色，荚膜无色透明。
湿墨水法
（1）制菌液：加1滴墨水于洁净的载玻片上，挑少量菌体与其充分混合均匀。 （2）加盖玻片 放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸去多余的菌液。
（3）镜检：先用低倍镜、再用高倍镜观察。
结果：背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即为荚膜。 干墨水法
（1）制菌液：加1滴6%葡萄糖液于洁净载玻片一端，挑少量胶质芽胞杆菌与其充分混合，再加1环墨水，充分混匀。
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（2）制片：左手执玻片，右手另拿一边缘光滑的载玻片，将载玻片的一边与菌液接触，使菌液沿玻片接触处散开，然后以30度角，迅速而均匀地将菌液拉向玻片的一端，使菌液铺成一薄膜。
（3）干燥：空气中自然干燥。
（4）固定：用甲醇浸没涂片，固定1 min，立即倾去甲醇。 （5）干燥：在酒精灯上方，用文火干燥。 （6）染色：用甲基紫染1—2min。 （7）水洗：用自来水轻洗，自然干燥。
（8）镜检：先用低倍镜再高倍镜观察。 结果：背景灰色，菌体紫色，荚膜呈一清晰透明圈。
Tyler法
（1）涂片：按常规法涂片，可多挑些菌体与水充分混合，并将粘稠的菌液尽量涂开，但涂布的面积不宜过大。
（2）干燥：在空气中自然干燥。 （3）染色：用Tyler染色液染5—7min。
（4）脱色：用20%CuSO4水溶液洗去结晶紫，脱色要适度（冲洗2遍）。用吸水纸吸干，并立即加1—2滴香柏油于涂片处，以防止CuSO4结晶的形成。
（5）镜检：先用低倍镜再用高倍镜观察。观察完毕后注意用二甲苯擦去镜头上的香柏油。 结果：背景蓝紫色，菌体紫色，荚膜无色或浅紫色。
2、放线菌细胞形态观察
插片法观察放线菌的基内菌丝、气生菌丝以及孢子丝的着生状态，并绘图。 （1）倒平板
将高氏1号培养基熔化后，倒10~12 mL左右于灭菌培养皿内，凝固后使用。 （2）插片
将灭菌的盖玻片以45度角插入培养皿内的培养基中，插入深度约为盖玻片的1/2或1/3。
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（3）接种与培养
用接种环将菌种接种在盖玻片与琼脂相接的沿线，放置28 ℃培养箱内培养3～7 天。
（4）观察
培养后菌丝体生长在培养基及盖玻片上，小心用镊子将盖玻片抽出，轻轻擦去生长较差的一面的菌丝体，将生长良好的菌丝体面向载玻片，压放于载玻片上。直接在显微镜下观察。
3、霉菌细胞形态观察
水浸片法观察霉菌的基内菌丝、气生菌丝以及气生菌丝的特化状态，并绘图。 水浸片法 （1） 制片
取干净载玻片一张，于中央滴加乳酸石碳酸棉蓝液一滴，用解剖针从菌落边缘划取菌丝体一小块，放入乳酸石碳酸棉蓝液中，小心地加盖玻片一张，并轻压盖玻片（勿使产生气泡）
（2） 镜检
在低倍镜或高倍镜下观察。观察时注意菌丝体有无隔膜、假根、足细胞等特殊构造，并观察孢子的形态、大小和着生方式。
（三）生理生化特性鉴定 1、细菌
由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。
(1) 淀粉水解试验：
在含2%淀粉的牛肉膏蛋白胨琼脂固体培养基上接种细菌，培养两天以后，再往培养基中加碘液染色，若该细菌能分泌胞外淀粉酶，则能利用其周围的淀粉，淡然在染色后，其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈。
(2) 糖发酵试验：
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