此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，保藏期在1年以上。因操作简单，经济实惠，工厂较多采用。中国科学院微生物研究所采用麸皮保藏法保藏曲霉，如米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉等，其保藏期可达数年至数十年。
5、冷冻真空干燥保藏法
冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。并在真空条件下立即融封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物质。
由于此法同时具备低温、干燥、缺氧的菌种保藏条件，因此保藏期长，一般达5～15年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。除不产孢子的丝状真菌不宜用此法外，其他大多数微生物如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等均可采用这种保藏方法。但该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。
保藏菌种需用时，可在无菌环境下开启安瓿管，将无菌的培养基注入安瓿管中，固体菌块溶解后，摇匀复水，然后将其接种于适宜该菌种生长的斜面上适温培养即可。
6、甘油管低温保藏法
A、将要保存菌种接种于LB液体培养至对数生长期（肉眼见培养体系内浑浊即可）； B、将甘油稀释至浓度为50%（等体积蒸馏水加等体积甘油，甘油需要慢慢吸）； C、将甘油、2 ml离心管、枪头等试验用品于121℃灭菌20min
D、无菌条件下将菌液与50%浓度甘油1:1等体积混合于离心管中，甘油终浓度为25% 5 于-20℃或-80℃冰箱内保存
7、液氮超低温保藏法
液氮超低温保藏法简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（-196℃）下保藏的方法。其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。美国ATCC菌种保藏中心采用该法时，把菌悬液或带菌丝的琼脂块
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经控制致冷速度，以每分钟下降1℃/min 的速度从0℃直降到-35℃，然后保藏在-150℃～-196℃液氮冷箱中。如果降温速度过快，由于细胞内自由水来不及渗出胞外，形成冰晶就会损伤细胞。据研究认为降温的速度控制在(1～10)℃/min，细胞死亡率低；随着速度加快，死亡率则相应提高。
液氮低温保藏的保护剂，一般是选择甘油、二甲基亚砜、糊精、血清蛋白、聚乙烯氮戊环、吐温80等，但最常用的是甘油（10%～20%）。不同微生物要选择不同的保护剂，再通过试验加以确定保护剂的浓度，原则上是控制在不足以造成微生物致死的浓度。
此法操作简便、高效、保藏期一般可达到15年以上，是目前被公认的最有效的菌种长期保藏技术之一。除了少数对低温损伤敏感的微生物外，该法适用于各种微生物菌种的保藏，甚至连藻类、原生动物、支原体等都能用此法获得有效的保藏。此法的另一大优点是可使用各种培养形式的微生物进行保藏，无论是孢子或菌体、液体培养物或固体培养物均可采用该保藏法。其缺点是需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用较高。
要使用菌种时，从液氮罐中取出安瓿瓶，并迅速放到35～40℃温水中，使之冰冻熔化，以无菌操作打开安瓿瓶，移接到保藏前使用的同一种培养基斜面上进行培养。从液氮罐中取出安瓿瓶时速度要快，一般不超过1min，以防其他安瓿瓶升温而影响保藏质量。并且取样时一定要戴专用手套以防止意外爆炸和冻伤。
五、注意事项
1、革兰氏染色是载玻片要洁净无油滴，滴水和取菌不宜过多，涂片是量应少而薄，并且要涂抹均匀，但不要反复涂布。固定时应注意防止温度过高，以玻片背面不烫手为宜。用水冲洗时不要 直接冲在样品涂布面上，而应使水从载玻片一端流下，且水流要缓慢，不宜过急、过大。
2、荚膜染色时，荚膜薄，含水量在90%以上，易变形，在制片过程中不能用加热方法固定，以免荚膜皱缩变形。墨汁负染色法时加盖玻片不要有气泡，否则会影响观察。
3、培养放线菌时要注意，放线菌的生长速度较慢，培养期较长，在操作过程中应特别注意无菌操作，防止杂菌污染。
4、霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，且孢子容易飞散，所以制作标本时常用乳酸石碳酸棉蓝染色液。
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六、思考题
1、细菌利用糖类的过程中，产生的酸性物质和气体可能是什么？ 2、如果区别细菌、放线菌、霉菌菌落？
3、在高倍镜或油镜下如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝？ 4、淀粉水解的原理是什么？本方法是否适用于所有的微生物？ 5、菌种保藏工作的重要意义何在？各方面的基本原理是什么？
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实验三 变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析技术及其在微
生物种群多样性研究中的应用
一、实验目的
1、了解并掌握变性梯度凝胶电泳的原理。
2、掌握变性梯度凝胶电泳分析植物内生菌种群多样性。
二、实验原理及其应用
1、实验原理
变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）是一种根据DNA片段在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链，称之为变性。核酸50%发生变性时的温度称为熔解温度（Tm）。Tm值主要取决于DNA分子中GC含量的多少。DGGE将凝胶设置在双重变性条件下：温度50~60 ℃，变性剂0~100%。当一双链DNA片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时，此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段DNA的低熔点区的Tm值，此区便开始熔解，而高熔点区仍为双链。这种局部解链的DNA分子迁移率发生改变，达到分离的效果。Tm的改变依赖于DNA序列，即使一个碱基的替代就可引起Tm值的升高和降低。因此，DGGE可以检测DNA分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以及少于10个碱基的缺失突变。许多研究表明变性递度凝胶电泳分离能力很强，它可以把相差仅1bp 的DNA 片段分开。
为了提高DGGE的突变检出率，可以人为地加入一个高熔点区——GC夹。GC夹（GC clamp）就是在一侧引物的5′端加上一个30~40bp的GC结构，这样在PCR产物的一侧可产生一个高熔点区，使相应的感兴趣的序列处于低熔点区而便于分析。因此，DGGE的突变检出率可提高到接近于100%。 作为一种突变检测技术，DGGE具有如下的优点：
（1）突变检出率高。DGGE的突变检出率为99%以上；
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（2）检测片段长度可达1kb，尤其适用于100~500bp的片段；
（3）非同位素性。DGGE不需同位素掺入，可避免同位素污染及对人体造成的伤害；
（4）操作简便、快速。DGGE一般在24小时内即可获得结果；
（5）重复性好。但是，该方法需要特殊的仪器，而且合成带GC夹的引物也比较昂贵。
2、应用
1993年Muzyers首次将DGGE技术应用于分子微生物学研究领域，目前已经被用于活性污泥生物膜、土壤、底泥等环境样品中的微生物多样性检测和种群演替的分析。该技术已经成为微生物群落动态和多样性分析的最有力工具之一。DGGE可以分辨出长度相同但序列不同的DNA片段，通过分离直接从样品中扩增出的16S rDNA片段分析群落结构。活性污泥在废水处理过程中被广泛应用，污泥中的菌群直接影响处理效果，只有了解微生物群落多样性和动态性等信息，才能提高对处理系统的控制能力。活性污泥微生物种类极其丰富，只有0.1%——1%的微生物种类通过常规方法能被培养，若以这极少部分的微生物来代表环境和处理系统中复杂的微生物群体将导致极大的误差。因此，用传统的微生物培养和鉴定方法不足以代表微环境中的真实情况。
该技术直接从样品中提取包括可培养和不可培养微生物在内的总DNA，再经过PCR扩增、电泳、统计分析，提供群落中优势种类信息和同时分析多个样品，具有可重复、快速和操作简便等优点，广泛应用于土壤、活性污泥等环境微生物生态以及植物内生菌多样性的研究中。
三、实验材料
1、实验材料 生长健壮的植株。 2、实验仪器
PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、变性梯度凝胶电泳仪（仪器型号：Decode Universal Mutation Detection System）、凝胶成像及分析系统、高速离心机。
3、实验试剂 （1）CTAB-NaCl
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