（1）高氏一号培养基平板的制备：待高氏一号培养基熔化后，冷却至手摸不烫时，取10mL刻度试管，趁热倒入培养基至10mL刻度，立即倒入9cm的培养皿中，制成厚薄均匀的培养基平板，备用。
（2）放线菌接种：在无菌条件下，从分离的平板中接种放线菌培养2~3天，备用。 （3）真菌接种：用4mm打孔器从分离的平板上打制菌饼，然后将菌饼面朝下紧贴于PDA培养基接种到培养基平板一侧，然后加盖并标记（操作要迅速准确，菌饼放下后就不能够再移动）。于适宜温度（一般为25~28摄氏度）的培养室或培养箱中黑暗培养。
（4）结果检查：培养5~7天后，取出PDA平板，用卡尺测量真菌菌落和放线菌菌落边缘之间的抑菌距离，单位为毫米（mm）。
3、细菌与放线菌
（1）细菌菌悬液的制备：对分离得到的细菌，接种到NA液体培养基中，培养过夜，备用。
（2）高氏一号培养基平板的制备：待高氏一号培养基熔化后，冷却至手摸不烫时，取10mL刻度试管，趁热倒入培养基至10mL刻度，立即倒入9cm的培养皿中，制成厚薄均匀的培养基平板，备用。
（3）细菌接种：在无菌条件下，将制备好的细菌菌悬液涂布到高氏一号培养基平板，备用。
（4）放线菌接种：在无菌条件下，从分离的平板中接种放线菌与上述平板中央，然后加盖并标记。于适宜温度（一般为25~28摄氏度）的培养室或培养箱中黑暗培养。
（4）结果检查：培养2~3天后，取出平板，用卡尺测量细菌菌落和放线菌菌落边缘之间的抑菌圈直径，单位为毫米（mm）。 （七）拮抗菌的保藏——短期保藏
对具有拮抗作用的细菌、放线菌、真菌分别接种到NA培养基平板、高氏一号培养基平板、PDA培养基平板，经培养后存放于4℃冰箱保存（保藏期限1~3个月），备用。
五、注意事项
1、称量药品后应做好标记，勿与其它药品混在一起，称完药品应及时盖紧瓶盖。 2、注意pH值不要调过头，以免影响培养基内各离子的浓度。
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3、应用记号笔在相应的位置注明培养基的名称、组别和日期。 4、放线菌的生长时间比较长，故制作平板时，培养基的量应多加一些。
5、观察菌落特点时应选择分离的较开的很大的菌落，对培养基和试管要编好号码，不要随意移动开盖，以免搞混菌号获受到污染。
6、实验完成后，应即时对实验数据进行收集、处理。
7、在利用平板对峙法分析真菌与细菌、真菌与放线菌之间是否有拮抗作用时，接菌后菌丝块勿移动。
六、结果分析
1、对菌落数进行观察记录，填入下表。并计算每克土壤中不同种类微生物的数量，并与理论值进行比较分析。
天 第一天 浓度 10-1 10-2 10-3
高氏一号 培养基
10-4 10-5 10-6
NA 培养基
10-7 10-8 10-9
① ②
第二天 ①
②
第三天 ①
②
第四天 ①
②
第五天 ①
②
第六天 ①
②
培养基 PDA 培养基
2、平板对峙法结果分析
记录实验结果，分析真菌与细菌、真菌与放线菌之间是否有拮抗作用？
七、思考题
1、固体培养基加琼脂后加热溶化时要注意哪些问题？ 2、培养基中加琼脂的作用是什么？
3、干热灭菌、高压蒸汽灭菌和间歇灭菌的场合有何不同？
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4、如何检查培养基灭菌是否彻底？ 5、平板培养时为什么要把培养皿倒置？
6、在划线分离时，为什么每次都需要将接种环上的剩余物烧掉？ 7、总结几种接种技术的要点及注意事项。 8、分离不同类群的微生物为何要选不同的稀释度？
9、稀释平板分离测数法与血球计数板测数法各有何优缺点？ 10、何为拮抗作用？举例说明微生物与微生物之间的拮抗关系。
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实验二 拮抗菌的鉴定与保藏
一、实验目的
1、掌握微生物菌种鉴定的常规方法。 2、掌握微生物菌种的保藏方法。
二、实验原理
微生物菌种鉴定对于更好的认识和利用微生物菌种具有重要的理论和实践意义。目前常用的菌种鉴定方法包括形态学观察、生理生化特性鉴定、BIOLOG碳源自动分析鉴定、分子生物学鉴定、API细菌数值鉴定、功能性分析及功能基因、RAPD、SSCP、TLC薄层层析、全细胞脂肪酸分析鉴定、（G＋C）mol％测定、DNA/DNA同源性测定等。
（1）常规鉴定
常规鉴定内容有形态特征和理化特性。形态特征包括显微形态和培养特征；理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代谢反应、酶反应和血清学反应等。 （2）BIOLOG碳源自动分析鉴定
BIOLOG鉴定系统以微生物对不同碳源的利用情况为基础，检测微生物的特征指纹图谱，建立与微生物种类相对应的数据库。通过软件将待测微生物与数据库参比，得出鉴定结果。
（3）分子生物学鉴定
应用分子生物学方法从遗传进化角度阐明微生物种群之间的分类学关系，是目前微生物分类学研究普遍采用的鉴定方法。可采用核酸序列分析法分析细菌16S
rDNA/16S-23S rDNA区间序列、酵母18S rDNA/26S rDNA（D1/D2）序列及丝状真菌的18S rDNA/ ITS1-5.8S-ITS2序列。
（4）API细菌数值鉴定系统
API鉴定系统涵盖15个鉴定系列，约有1000种生化反应，目前已可鉴定超过600种的细菌。鉴定过程中，可根据细菌所属类群选择适当的生理生化鉴定系列，通过软件将待测细菌与数据库参比，得出鉴定结果。 （5）功能性分析及功能基因
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目前通过木聚糖酶、纤维素酶、葡萄糖异构酶、β-甘露聚糖酶等功能基因的克隆进行菌种产酶的功能性分析。应用gyrA、atpD及pheS等看家基因于微生物菌种鉴定，在某些种、亚种、株间有较好的分辨效果。 （6）RAPD、SSCP技术
采用随机扩增多态性DNA（Randomly amplified polymorphism DNA，RAPD）技术和单链构象多态性(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP）技术对微生物菌株进行鉴别。如采用RAPD技术能够对同一菌种原始菌株与诱变菌株进行鉴别，对诱变菌株知识产权保护具有重要意义；采用SSCP技术进行工业酒精酵母菌株的鉴别，此技术结合菌株发酵特性，在酒类生产的质量控制方面起到积极作用 （7）TLC薄层层析
TLC薄层层析技术应用于微生物菌种鉴定，进行细菌、放线菌细胞壁化学组分分析（氨基酸、糖），作为划分属特征的重要鉴定技术手段，起到了良好的辅助作用。 （8）全细胞脂肪酸分析鉴定系统
采用Sherlock全自动细菌鉴定系统，通过对不同菌株的脂肪酸图谱进行分析，并与标准数据库进行比对，来鉴定细菌及酵母。该技术是细菌或酵母种水平鉴定的有效手段之一。
（9）（G＋C）mol％及DNA/DNA杂交
采用DU800核酸蛋白分析仪测定Tm值，从而得到微生物菌株的（G＋C）mol％，并与模式菌株进行DNA/DNA同源性分析，该鉴定技术手段是多相鉴定的重要组成部分。
三、实验材料
1、器材：电子天平、带有玻璃珠的三角瓶、摇床、1mL的无菌吸管、10mL的刻度试管、无菌水、搪瓷缸、玻璃涂棒、牛角匙、pH试纸、封口膜、记号笔、线绳、纱布、培养皿、高压蒸汽灭菌器、称量纸、药匙、试管架、涂布棒、酒精灯、超净工作台、火柴。
2、试剂和材料：无菌牛皮纸袋、无菌铲、标签、打孔器，镊子，牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、 葡萄糖、1mol/L NaOH、1mol/LHCl、75%酒精、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、蒸馏水、新鲜马铃薯、10%酚酞、乳酸。
四、实验步骤
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