常使用的浓度是1％~3％，加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质。琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较好的抗对流性质。琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。尽管琼脂糖本身没有电荷，但一些糖基可能会被羧基、甲氧基特别是硫酸根不同程度的取代，使得琼脂糖凝胶表面带有一定的电荷，引起电泳过程中发生电渗以及样品和凝胶间的静电相互作用，影响分离效果。
琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于核酸的提纯、分析。如浓度为1％的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说是比较大的，对蛋白质的阻碍作用较小，这时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小，所以适用于一些忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。琼脂糖也适合于DNA、RNA分子的分离、分析，由于DNA、RNA分子通常较大，所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用，这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。例如对于双链DNA，电泳迁移率的大小主要与DNA分子大小有关，而与碱基排列及组成无关。另外，一些低熔点的琼脂糖其中的样品如DNA可以重新溶解到溶液中而回收。 由于琼脂糖凝胶的弹性较差，难以从小管中取出，所以一般琼脂糖凝胶不适合于管状电泳，管状电泳通常采用聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶通常是形成水平式板状凝胶，用于等电聚焦、免疫电泳等蛋白质电泳，以及DNA、RNA的分析。垂直式电泳应用得相对较少。
实验方法：
（1）蛋白样品制备：
1. 单层贴壁细胞总蛋白的提取：（6孔培养板）
(1)倒掉培养液，加入1mL 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.4），洗细胞。 (2)将液体移除，每孔加细胞裂解液200～400μL作用1min。轻轻吹打（尽量不要起沫）。
(3)移入EP管内，振荡器室温下轻微振荡10min。
(4)裂解完后，于4℃下8000rpm离心10min。（提前开离心机预冷） (5)将离心后的上清分装转移至0.5mL离心管中,或40μL分装放于-20℃保存。
加药物处理的贴壁细胞由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按上述操作外还应离心（1200rpm，5min）收集培养液中的细胞，移入EP管一同裂解。 2. 组织中总蛋白的提取：
(1)将少量组织块置于1～2mL匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。（可先剪成小块，-80℃或液氮中反复冻融三次后再匀浆，每次10min） (2)加400～500 μL裂解液裂于匀浆器中进行匀浆,然后置于冰上。 (3)几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。 (4)裂解30min后，即可用移液器将裂解液移至1.5mL离心管中，然后在4℃下8000rpm离心10min，取上清分装于0.5mL离心管中或40μL分装并置于-20℃保存。
3. 悬浮细胞（6孔板）收集离心1000rpm，5min，PBS洗一次。裂解方法同贴壁细胞。
（2）蛋白含量的测定
1. 制作标准曲线
96孔板，按下表加入，每组3个孔，5min后，OD595或600nm检测，绘制标准曲线。 浓度 1mg/mL BSA buffer 0mg/mL 0 30?L 0.2mg/mL 6?L 24?L 0.4mg/mL 0.6mg/mL 12?L 18?L 18?L 12?L 0.8mg/mL 24?L 6?L 1.0mg/mL 30?L 0?L 待测 Sample ? G250
200?L 200?L 200?L 200?L 200?L 200?L 200?L 2. 根据标准曲线计算出样品蛋白含量。 注意事项:
样品蛋白含量的OD值应在曲线范围内，即在0mg/mL~1mg/mL BSA的OD值之内。如果不在线性范围内，应适当稀释或浓缩。样品总体积为30μL。BSA一般用生理盐水或注射用水配制，buffer为生理盐水或注射用水。
（3）SDS-PAGE实验步骤:
1. 清洗玻璃板：
一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立即晾干。 2. 灌胶与上样
⑴玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）
⑵按第二版《分子克隆手册》方法（见后面附录）配12％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时可用1mL枪吸取分离胶液沿玻璃灌注，待胶面升到适合高度时即可（分离胶一般3.4mL即可）。然后加水液封(要很慢，否则胶体会被冲变型，一般需加水60?L）。灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶液一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。 ⑶当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
⑷按第二版《分子克隆手册》方法（见后面附录）配5％的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。 ⑸取出测完蛋白含量的上样样品至0.5mL离心管中，加入5×SDS 上样缓冲溶液，即4?L样品加1?L上样缓冲溶液（上样总体积一般不超过30?L），上样前要将样品置于恒温金属浴100℃中加热5min使蛋白变性。（预染marker无需加热） ⑹待到浓缩胶凝固（约20min）后，将其放入电泳槽中（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且光滑的一面面向外）。加足够的电泳液后（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板），两手分别捏住
梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
⑺开始准备上样。用微量进样器或上样枪贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头或枪头插至加样孔中缓慢加入样品。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。 3. 电泳(BIO-RAD Basic 电泳仪)
电泳时间一般45～60 min，电压为200V较好。电泳至溴酚兰将要跑出即可终止电泳，进行转膜。
（4）转膜步骤（适用于0.75mm胶半干转）：
1. 电泳结束后将胶切成适合大小（切去一小角做为标记，如有预染Marker不用切），放入转膜缓冲液中平衡（15min～30min）。海绵滤纸剪至与胶相同大小，共四块，放入转膜缓冲液中平衡。
2. 0.22?m PVDF膜（无正反面）剪至比胶略大，先用100%甲醇浸泡30s，再放入转膜缓冲液中平衡。（15min～30min） 3. 转膜
从下而上顺序：+阳极-两层海绵滤纸、PVDF膜、凝胶、两层海绵滤纸-阴极- 每一步都要注意去除气泡，建议都在转膜液中进行。放入BIO-RAD半干转仪（注意:膜在下胶在上），安装好装置，接通BIO-RAD PowerPac HC 电泳仪电源，15v 15min或10v 30min（根据实验结果可适当延长和缩短时间，但电压不变）。
4. 转移结束后，关闭电源取出膜（记住有蛋白是哪面，可用圆珠笔画点标记），TBS洗1min（膜取出后应马上浸入TBS中）。 注意事项：
半干转仪用完后，先擦净表面的转膜液，晾干后收好
（5）免疫反应：
1. 在适合大小的容器内加入封闭液（TBS配5%脱脂奶粉），放入已洗好的膜（膜应完全浸入封闭液中，1mL/cm2），80转振荡，室温（应高于20℃）1h或4℃过夜。
2. 在一张适合大小的保鲜膜（也可用自封袋）上加一抗（用封闭液稀释至适合浓度），将膜有蛋白的一面向下扣在一抗液体上，一抗液应与膜蛋白面完全接
触，80转振荡，室温1h（时间可适当延长或4℃过夜）。 3. TBST冲洗三次，TBST洗三次×10min，150转振荡。
4. 在一张适合大小的保鲜膜（也可用自封袋）上加二抗（用封闭液稀释至适合浓度），将膜有蛋白的一面向下扣在二抗液体上，二抗液应与膜蛋白面完全接触，80转振荡，室温1h。
5. TBST冲洗三次，TBST洗三次×10min，150转振荡。
6. 加入底物显色液（OPD+H2O2）,一般2～3min后条带开始出现，30～60s后双蒸水冲洗终止显色，拍照。（ECL发光可省此步骤） 注意事项：
一抗、二抗使用浓度，时间及温度对不同的蛋白都要经过预实验确定最佳条件。
OPD有致癌性，使用时要小心; H2O2要最后加。
（6）化学发光，显影，定影
1. 将ECL发光试剂盒中A和B两种试剂先放在室温一段时间，然后等体积混合。将膜蛋白面朝上放在保鲜膜上（膜应尽量去除表面洗液，但不能使膜干）。将发光液淋在膜上（试剂盒要求0.1mL/cm2，淋在膜蛋白面上，铺满即可）。1～5min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液（但不能使膜干），包好（无气泡），放入X-光片夹中。
2. 在暗室中，将1×显影液和定影液分别倒入塑料盘中，另准备两盘蒸馏水。在红灯下取出X－光片，剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大一些）。打开X-光片夹，把X－光片放在膜蛋白面上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时。根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min～5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果。曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为3～10min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间。显影结束后，马上把X-光片浸入蒸馏水中清洗，再放入定影液中，定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止。用蒸馏水冲去残留的定影液后，室温下晾干。 （显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，镊子不要划伤胶片，否则会对结果产生影响）