台仪器的问世,科技工作者进行了不懈的努力。随着各相关技术的迅速发展，FCM技术已经成为日益完善的细胞分析和分选的工具。
（1）流式细胞仪的结构与原理
1.流式细胞技术的特点:
1） 分析对象：单细胞悬液或生物颗粒。 2） 分析速度：快速，最高达上万个细胞/秒。
3） 检测参数：多参数（两个散射光参数、多个荧光参数）
4） 可同时测定多种可溶性细胞成分：流式微球芯片技术（Cytometric Beads
Array,CBA）
5） 检测结果：精度高、准确性好 6） 先进的细胞定量技术 2.流式细胞仪的分类：
临床型：光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易掌握，适用于临床常规测试。
科研型：分辨率高，选配多种波长和类型激光器，可将感兴趣细胞分选到特定培养孔或板上，适用于科研。
3.流式细胞仪的结构：
流式细胞仪主要由三部分组成：流动室和液流系统、光路系统、电系统。
流路（液流系统）： ? 流动室 ? 鞘液SHEATH
? 样本流SAMPLE 单细胞悬液5*105~1*106个/mL 光路（光学系统）: ? 光源 ? 滤片
? 光电倍增管PMT HV 电路（电路系统）：
? 放大电路HV及GAIN 增益 ? A/D转换 分析系统：计算机 其作用如下：
液流系统：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区。
光路系统：细胞由激光激发，通过光学滤片产生光信号，并传送到相应的探测器。 电系统：把光信号转换为电信号。 4．流式细胞仪基本原理
在流式细胞仪中，细胞被传送到液流中的激光照射区。任何存在于悬液中的直径为0.2-150微米的粒子或细胞都适用于流式分析。在实际工作中，用实体组织进行流式细胞分析往往是不可能的，分析之前必须对其进行分解。被液滴包绕的粒子称为细胞液柱，当粒子经过激光照射区时，通过激光激发产生散射光。含有荧光的粒子就会表现出其荧光特性。散射光和荧光由光路系统（相应的透镜，滤片和探测器）收集。分光器和滤光片引导散射光和荧光至相应的探测器，把光信号转换为电信号。液流系统的作用是依次传送待测样本中的细胞到激光照射区，其理想状态是把细胞传送到激光束的中心。而且在特定时间内，应该只有一个细胞或粒子通过激光束。 因此，必须在流动室内把细胞注入鞘液流。流动室是液流系统的核心部件，台式机中流动室称为样品槽，大型机称之为喷嘴。在流动室内细胞液柱聚焦于鞘液中心，细胞在此与激光相交。高流速适用于定性测量，如免疫表型。样本流变宽，细胞间距离缩短，这样在单位时间内流经激光照射区
的细胞数量增加，可以快速获取数据。低流速促使样本流变窄，单个细胞得以依次通过，这样大多数细胞可流经激光束的中心，细胞受激光照射的能量比较均一，因而低流速适用于检测分辨率要求高的实验，如DNA分析。 检测信号：
前向角散射：前向角散射（FSC）光，在激光束正前方的检测器，与被测细胞的大小和面积有关，检测的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向的散射光信号。FSC不受细胞荧光染色的影响，常用于免疫表型分析的信号处理。FSC的强度与细胞或其它颗粒的大小，形状有关，用于检测细胞或其它颗粒的表面属性，如大小。
侧向角散射：侧向角散射（SSC）光，与激光束垂直方向的检测器，也称为90度散射光检测器，与被测细胞的颗粒密度和内部结构有关，对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感。 荧光信号：
? 光物质吸收符合其波长范围的光能量，内部电子受激上升到高能级。然后
受激电子迅速衰落回基态，释放过剩能量成为光子。这种能量的转换称为荧光。
? 能够激发荧光物质的波长范围称为激发光谱。因为更多的能量消耗在吸收
转换而不是荧光转换中，所以发射光波长要高于激发光波长。荧光物质的发射波长范围叫做发射光谱。
? 对单克隆抗体进行荧光染色，通过分析细胞表面抗原标记。
? 确认细胞类型。在细胞的混合群体中，我们使用不同的荧光染料区分细胞
亚群。每个亚群的染色模式与FSC和SSC数据相结合，用于识别样本中的细胞种类，并可以得到各细胞亚群的百分含量。而且，还可以对感兴趣的细胞进行再分选。
（2）流式细胞仪的操作规程：
仪器名称：流式细胞仪
生产厂家：美国贝克曼库尔特有限公司 使用方法： 一．开机程序
1．检查稳压器电源，打开电源，稳定5分钟。
2．打开储液箱，倒掉废液, 并在废液桶中加入400mL漂白水原液。打开压力阀，取出鞘液桶，将鞘液桶加至4/5满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFlow），合上压力阀。确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。 3．将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY，预热5－10分钟。排出过滤器内的气泡。 4．如果需要打印，打开打印机电源。
5．打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志。
6．执行仪器PRIME功能一次，以排除Flow cell中的气泡。
7．分析样品时，先用FACAFlow 或PBS进行HIGH RUN约2分钟。 做过分选后，每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个50mL离心管，不
接通浓缩系统，摁下右下角白色按钮开始冲洗。待自动停止后接通浓缩装置，同上法冲洗一次。
二．预设获取模式文件(Acquisition Template Files)
1．从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗，可利用此视窗编辑一个获取模式文件。
2．选取屏幕左列绘图工具中的Dot plot，绘出一个或多个Dot Plots（点图）。从Dot Plot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源，并确定适当的x轴和y轴参数。
3．选取屏幕左列绘图工具中的Histogram，同上法可绘出Histogram（直方图）。 4．将此视窗命名后储存于FACStation G3\\BD Applications \\CELLQuest Folder \\EXP文件夹中，下次进行相同实验时可直接调用。
计算机中已设定两个模式文件：ACQ和EXP，储存于FACStation G3\\BD Applications \\CELLQuest \\EXP文件夹中，ACQ用于细胞DNA检测，EXP用于细胞表面标志分析。
三．用CELLQuest进行仪器的设定和调整
1．从苹果画面中选取CELLQuest，进入CELLQuest后在File指令栏中打开合适的获取模式文件。
2．从屏幕上方Acquire指令栏中，选取Connect to Cytometer（快捷键： ＋B）进行电脑和仪器的连机。将出现的Acquisiton Control对话框移至合适位置。 3．从Cytometer指令栏中，开启Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status等四个对话框，并将它们移至屏幕右方，以便获取数据时随时调整获取条件。也可以用 +1，2，3，4获得此四个对话框。
4．在Detectors/Amps对话框中，先为每个参数选择适当的倍增模式(amplifier mode)：线性模式Lin或对数模式Log。一般进行细胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴细胞亚群时，FSC和SSC多以线性模式Lin测量，且DDM Param选择FL2，而FL1, FL2与FL3则以对数模式Log测量；分析细胞DNA含量时，FSC，SSC，FL1，FL2，FL3皆以Lin进行测量，且DDM Param选择FL2；分析血小板表型时，FSC，SSC，FL1，FL2，FL3等均以Log进行测量。