强离子交换剂的电离率基本不受pH值影响，离子交换作用的pH范围宽，而弱离子交换剂的电离率受pH影响很大，离子交换作用的pH范围小。
常用的阳离子交换填料：CM Sepharose Fast Flow，SP Sepharose Fast Flow，SP SepharoseTM XL，Capto MMC等。
常用的阴离子交换填料：DEAE Sepharose Fast Flow，Q Sepharose Fast Flow，Q SepharoseTM XL等。
离子交换剂的选择：对于一个已知等电点的蛋白质，可根据其等电点来选择。如果选用阴离子交换剂，使用缓冲液的pH值应高于该蛋白质的等电点，因为此时蛋白质在该缓冲液中携带净负电荷，可与阴离子交换剂结合。如果选用阳离子交换剂，缓冲液的pH值应低于该蛋白质的等电点，因为此时蛋白质在该缓冲液中携带净正电荷，可与阳离子交换剂结合。
缓冲液的选择：
1. 阳离子交换剂应选用阴离子缓冲液：可用柠檬酸盐、醋酸盐、磷酸盐、
甘氨酸盐等。
2. 阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液：可用烷基胺、Tris、氨基乙醇胺、
乙二胺、咪唑等。
3. 起始缓冲液的浓度应尽可能低：可低于10mmol/L甚至更低，这样可以
使层析柱上更多地吸附分离物质。
4. 缓冲液应不含会影响被分离物质活性和溶解度的成分。 5. 洗脱时应尽量不采用pH梯度洗脱。
洗脱：上样后应先用足够量的起始缓冲液洗去未吸附组分，然后再开始洗脱。洗脱方法一般为梯度洗脱，即采用连续地增加缓冲液离子强度的方式进行洗脱，是一种连续的洗脱。可通过梯度混合器来进行。梯度洗脱的优点是在一定的pH条件下能观察到样品中所有蛋白质的大致分离情况。 四、利用选择性吸附的纯化方法
疏水作用层析：疏水作用层析就是根据蛋白质表面的疏水性差别发展起来的一种纯化技术。在疏水作用层析中，不是暴露的疏水基团促进蛋白质与蛋白质之间的相互作用，而是连接在支持介质（如琼脂糖）上的疏水基团与蛋白质表面上暴露的疏水基团结合。市售的疏水吸附剂有苯基琼脂糖、辛基琼脂糖等。为使吸
附达到最大，可将蛋白质样品的pH调至等电点附近。一旦蛋白质吸附于固定相，则可利用多种方式进行选择洗脱，包括使用逐渐降低离子强度或增加pH的洗脱液（增加蛋白质的亲水性），或使用对固定相的亲和力比对蛋白质更强的置换剂进行置换洗脱。
操作注意事项：
（1） 使用高浓度的盐以促进蛋白对疏水配基的结合。
使用疏水层析的前提是待分离蛋白必须可溶于高浓度的盐溶液中。常采用的盐溶液有：(NH4)2SO4(1.7mol/L)、NaCl(4mol/L)和KCl(4mol/L)。 （2） 温度：在常温下进行。
（3） 洗脱方式：可采用以下两种：1 用负盐梯度洗脱，这是最常用的洗脱
方式；2 用提高pH和降低温度的方式洗脱。
常用的疏水填料：Phenyl sepharose 6 Fast Flow(苯基)、Octyl Sepharose 4 Fast Flow(正辛烷基)、Butyl Sepharose 4 Fast flow(正辛烷基)。
五、利用配体的特异性亲和力的纯化方法
亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力，也即生物学亲和力，建立起来的一种有效的纯化方法。
亲和层析经常只需要经过一步的处理即可将某种所需蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并且纯度相当高。亲和层析最先用于酶的纯化并从中得到发展，但现在已广泛地用于核苷酸、核酸、免疫球蛋白、膜受体、细胞器甚至完整的细胞的纯化。
（3）蛋白纯化中的衔接技术
1. 蛋白质的浓缩： （1）离子交换层析 （2）亲和层系
（3）沉淀法：在提取液中加入适量的中性盐（如硫酸铵等）、有机溶剂，使有效成分变为沉淀，经离心或过滤，收集沉淀，再加入少量的缓冲溶液溶解沉淀。 （4）吸收浓缩法：通过加入吸收剂从溶液中吸收水或溶剂而使溶液达到浓缩的方法。常用的吸收剂有各种凝胶、聚乙二醇、葡聚糖等。 （5）超滤法：
超滤杯 0.5mL超滤离心管 15mL超滤离心管
超滤是加膜分离技术之一，其原理和一般过滤一样，主要依赖于被分离物质
分子量的大小、形状和性质的不同，在一定的压力差（外源氮气或真空泵、离心）下使小分子能够通过具有一定孔径的特制薄膜，大于孔径截留分子量的蛋白质不能透过膜，小于孔径截留分子量的蛋白质和杂质能透过膜，以此达到分离的目的。 （6）干燥法：干燥是将潮湿的固体浓缩液和液体中的水分或溶剂除去的过程。干燥的目的是提高产品的稳定性使其符合规定的标准，以便于对产品进行分析、应用和保存。
冷冻干燥：是先将溶液冷冻为固态，而后再在低温和高真空度的情况下使冰升华，从而使溶液中的溶质变为固态。 2. 蛋白质的脱盐：
脱盐是蛋白质纯化过程中的一个重要环节，可以把小分子与蛋白分子分离开来。通常脱盐效果的好坏对下一步层析纯化的实验结果有决定性的影响。常用的方法有透析、凝胶过滤层析、超微滤膜过滤。
（1） 透析：在分离蛋白质时，透析是除去蛋白质溶液中的小分子物质和盐的最
常用方法。透析法的特点是透析袋内外都是液相，透析袋内液是蛋白质样品，透析袋外液是水或缓冲液。透析袋内液的大分子蛋白质不能透过透析膜被截留于袋内，能透过透析膜的小分子物质经扩散不断透出膜外，直到透析袋内外两液相浓度达到平衡。
（2） 凝胶过滤层析：使用凝胶过滤介质Sephadex G10,G15,G25,G50等去除小
分子，效率高，处理量可达柱床体积30%。只需在进样后收集首1/3~1/2柱体积的洗脱液，就可以去除该填料分离范围上限以下的小分子，简单直接。
（3） 超微滤膜过滤：见蛋白质浓缩。 3. 蛋白质生物活性的保持：
蛋白质纯化的最终目的是得到有生物活性的蛋白纯品。因此在纯化过程中，为保证目的蛋白的活性，要从以下各方面注意： （1） 蛋白酶抑制剂：
破碎细胞提取蛋白质的同时，会释放出多种蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速被抑制才能保持蛋白质不被降解，最重要的是加入蛋白酶抑制剂。常用的蛋白酶抑制剂是细菌或者真菌合成的，它们的作用可以是可逆的也可以是不可逆的。 （2） 还原剂：
细胞内有许多种还原成分，一旦细胞破碎，由于和氧的接触以及稀释作用而使抗氧化成分减少，导致许多蛋白质被氧化而失去活性。如有一些含巯基的蛋白质，这些巯基可能是蛋白活性所必须的基团，在提取这种蛋白质时要注意尽量不要带入金属离子和氧化剂，还可以通过往提取液中加入金属螯合剂如EDTA等，加入还原剂如抗坏血酸、巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)等。另外某些蛋白质还可能带一些非共价键结合的配基，提取时要注意保护，不要使羧基丢失。 （3） 污染物的去除：
去除内毒素：内毒素又称热原，含脂肪A、糖类和蛋白质，是带负电的复合大分子。内毒素与阴离子交换介质Q或DEAE Sepharose Fast Flow有较强结合。可在洗脱目标蛋白后用高盐缓冲液或NaOH去除。内毒素经常是多聚体，凝胶过滤层析可有效地将之去除。
去除蛋白质中的核酸：样品中大量核酸的存在会增加样品黏度，令区带扩张，反压增加，降低分辨率和流速。药审和食检对核酸含量也有严格限制。胞内表达蛋白的核酸问题尤其严重。核酸带负电荷，在初步纯化时利用阳离子交换介质如STREAMLINE SP，SP或CM Sepharose FF，SP Sepharose XL结合目标蛋白，可去除大量核酸。另外，核酸在高盐下会和蛋白解离，疏水层析介质很适合用来结合目标蛋白，在纯化蛋白的同时去除核酸。 4. 蛋白质纯化过程中的纯度检测
高效液相色谱法：反相高效液相色谱法和凝胶高效液相色谱法，因分析速度快而常用于蛋白纯化过程中纯度和复性程度的分析。反相高效液相色谱法是利用
不同构型蛋白的疏水性不同，在反相色谱柱上会有不同的保留时间而鉴定蛋白质；凝胶高效液相色谱法是根据不同构型的蛋白的水化半径不同，在凝胶色谱柱上会有不同的保留时间来鉴定蛋白质。检测样品时，如果样品是纯的，且复性状态一致，应显示出单一的洗脱峰。
电泳法：SDS-PAGE简便易行，是蛋白质纯化过程中最常用的纯度监测方法。 免疫化学法：很多蛋白质都具有抗原性，如果给适当的动物注射特定的蛋白质时，可以刺激特异性抗体的产生。若只注射均一性的蛋白，则只产生一种抗体；如注射的蛋白是不均一的，则可产生几种抗体。只要杂质是抗原物质，这种检测方法是非常有效的。但如杂质无抗原性，此法便不适用了。
蛋白质化学结构分析法：蛋白质的氨基酸末端测定方法可用来测定蛋白质的纯度。对于一个纯蛋白质而言，通过N-末端的定量分析可以发现，每克分子蛋白质应该有整数克分子的N-末端氨基酸，如有少量其它末端的存在，常表示存在着杂质。如果只是定性测定N-末端，则此法只适用于仅有一条肽链的蛋白质。
五．流式细胞仪应用技术与方法 1.教学目的与要求：
1) 流式细胞仪的结构与原理 2) 流式细胞仪的操作规程 3) 流式细胞术的数据获取与分析 4) 流式细胞术的样本制备
2.教学内容：
流式细胞仪（Flow Cytometer 简称FCM）是一项集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。概括来说，流式细胞术就是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数的、快速的定量分析和分选的技术。从开始设想到第一