加入去离子水500mL，高压灭菌。 3．BMGY培养基: 胰化蛋白胨 20g 酵母提取物 10g
加入去离子水700mL，12l℃，15min高压灭菌，而后加入无菌的10×GY，10×YNB各100mL，2mL生物素(Biotin)，即配成BMGY培养基，使用时，按所需pH值加入1/10体积的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。 4．PTM1微量元素： CuSO4· 5H2O 6.0g
NaI 0.08g
MnSO4· H2O 3.0g NaMoO4· 2H2O 0.2g H3BO3 0.02g CoC12 0.5g ZnC12 20.0g FeSO4· 7H2O 65.0g H2SO4 5.0mL
加入去离子水至1L，用0.22μm的滤膜过滤除菌。 5. 改良的低浓度基础盐培养基: H3PO4(85%) 10.5mL CaSO4· 2H2O 3g K2SO4 48g MgSO4· 7H2O 39g KOH 13g Glycerol 1L
加入去离子水至20L在发酵罐121℃，30min高压灭菌。
（3）发酵罐的清洗及前期维护：
1. 清洗发酵罐，标定pH电极，并将pH电极、溶氧电极装入发酵罐，各阀门关闭，检查气密性。
2. 无菌空气：指通过除菌处理使空气的含菌量降低到零或极低，从而使污染的可能性降低到极小，不因空气污染造成损失的空气。在工程设计中一般要求1000次使用周期中只允许有一个菌通过，即经过滤后空气的无菌程度为N=10-3 个/罐。
（4）发酵罐灭菌：
发酵罐的结构比较复杂，对于内部的边边角角不容易消毒，一般的发酵罐有自动清洗装置，清洗完之后彻底灭菌 。
1. 实消：在培养基灭菌之前，通常应先将与罐相连的分空气过滤器用蒸汽灭菌并用空气吹干。实罐灭菌时，先将输料管路内的污水放掉冲净，然后将配制好的培养基泵送至发酵罐（种子罐或料罐）内，同时开动搅拌器进行灭菌。灭菌前先将各排气阀打开，将蒸汽引入夹套或蛇管进行预热，待罐温升至80~90℃，将排气阀逐渐关小。接着将蒸汽从进气口、排料口、取样口直接通入罐中（如有冲视罐也同时进汽），使罐温上升到118~120℃，罐压维持在0.09~0.1Mpa（表压），并保持30min左右。
各路进气要畅通，防止短路逆流，罐内液体翻动要激烈，各路排气也要畅通，但排气量不宜过大，以节约用气量。在保温阶段，凡进口在培养基液面以下的各管道及冲视镜管都应进气，凡开口在液面之上者均应排气。无论与罐连通的管路如何配制，在实消时均应遵循“不进则出”的原则。这样才能保证灭菌彻底，不留死角。保温结束后，依次关闭各排气、进气阀门，待罐内压力低于空气压力后，向罐内通入无菌空气，在夹套或蛇管中通冷却水降温，使培养基的温度降到所需的温度，进行下一步的发酵和培养。在引入无菌空气前，应注意罐压必须低于过滤器压力，否则物料将倒流入过滤器内，后果严重。灭菌时，总蒸汽管道压力要求不低于0.3~0.35Mpa，使用压力不低于0.2Mpa。
2. 空罐灭菌（空消）即发酵罐罐体的灭菌。空消时一般维持罐压0.15~0.2Mpa，罐温125~130℃，保持30~45min；要求总蒸汽压力不低于0.3~0.35Mpa，使用汽压不低于0.25~0.3MPa。
（5）接种菌体的生长：
1. 制种
①?? 复苏菌种:rLz-8毕赤酵母工程菌种由本实验室保存。将保存在密封好的冻存管内1mL左右的rLz- 8菌种从-80℃冰箱取出，室温缓慢溶解，在超净台内取出200μL加入121℃ 30min高压灭菌的1L三角烧瓶内含有200mL YPD培养基，28℃250rpm震荡培养24h。
②?? 菌种筛选:1)24h后超净台内取样，分光光度计600nm检测OD值，观察菌生长情况，在OD值在2~ 6范围内均可进行菌种筛选，分别将涂YPD固体培养基和加有G418的固体培养基铺板，取不同稀释倍数的菌液20μL进行涂菌，其中单设一组20μL纯水涂YPD固体培养基(做为空白对照组)，28℃~30℃恒温箱观察72h; 2)72h后，进行筛选。
③?? 菌体放大:l)观察空白对照组无菌体生长，G418的固体培养基菌体生长适宜，多在培养皿边缘，呈单克隆生长，可以进行挑菌; 2)超净台内将带有G418的固体培养基中单克隆生长合适的菌株进行挑菌，放入121℃30min高压灭菌的50mL离心管内含有10mL BMGY培养基中，用无菌透气膜封口，28℃250rpm震荡培养24h; 3)24h后根据菌体OD值和肉眼观察菌体颜色判断菌体生长情况，分光光度计600nm检测OD值，OD值在2~6范围内超净台内取样，颜色为淡黄色最佳，过深说明菌体生长过老，过浅说明菌体生长密度不足; 4)超净台内取菌体2mL加入121℃ 30min高压灭菌1L三角烧瓶内含200mL BMGY培养基中，28℃ 250rpm震荡培养24h; 5)培养24h后，取20mL加入121℃ 30min高压灭菌5L三角烧瓶内含有2L BMGY培养基中，28℃250rpm震荡培养24h，OD600≈10，此菌液做为种子液，准备上罐接种。 2. 上罐生物量的累积
①调校设备:校准发酵罐的pH电极、溶氧电极(在28℃时进行)，并进行蠕动泵的流量校准。
②配制20L改良的低浓度基础盐培养基和10g胰化蛋白胨，加入40L发酵罐，121℃，30min高压灭菌培养基、发酵罐及管道。
③待发酵罐内培养基灭菌并冷却后，设置以下参数:温度28℃，转速为600rpm，气体通入速率1.0vvm，空气混合器的参数为3.0。用氨水调节改良的基础盐培养基的pH值至5.0。无菌操作补加0.22μm过滤膜除菌的37.5mL PTM1微量元素和40mL生物素贮备液。
④将发酵罐顶部接种口打开，用酒精棉在口周围燃烧(减少污染，起灭菌作用)，然后将上述5L三角烧瓶内含有2L BMGY种子液开口，进行口部酒精灯外燃灭菌后迅速倒入发酵罐，立即关闭接种口，熄灭盖周围燃烧的酒精棉。开始发酵罐培养，此为第一阶段即甘油培养扩增菌体。发酵罐参数设置分别为搅拌速度600rpm，罐内压力10psi，温度28℃，控制均为P-I-D，维持DO值(溶解氧)在20%以上，必要时通入纯氧。
⑤发酵开始后，罐内会产生大量气泡，进行补加消泡剂，气泡消失，立即停止补加消泡剂。
⑥此阶段每6h取样1次，测OD600和细胞湿重，分析酵母菌生长状态，上罐后取样OD600为0.089，湿重为5.7g/L，肉眼和镜下观察菌液，排除杂菌污染，并留上清。
⑦约6h后，DO值逐步上升;约12h后湿重为15.3g/L，DO值在50%~60%，将搅拌速度600rpm升至800rpm;约18h后湿重为62.9g/L，发现DO在80%左右，说明培养基中甘油正处于消耗状态;约20h左右湿重为172g/L，发现DO值在20%~30%，说明培养基中甘油正处于不足状态，决定进行通低流纯氧，DO值回升至40~50%左右；约24h左右，菌体湿重达180g/L，DO值逐渐增至80~100%，说明培养基中甘油已消耗殆尽，转入补充甘油以进一步提高菌体密度阶段。 ⑧按照12mL/L PTM1微量元素的比例在高压灭菌后的50%甘油中，混匀后，蠕动泵以15mL·h-1·L-1流加速率补加，补加甘油过程中，DO值不能低于30%，可以通过提高搅拌转速和通纯氧保证氧供给。
⑨约30h，菌体湿重达220~240g/L，停止补加甘油，DO值迅速回升到100%，说明甘油已耗尽，继续维持30min的“甘油饥饿”状态，转入甲醇诱导表达阶段。
(6)甲醇诱导rLZ-8的表达
①甲醇诱导开始后，每隔6h取样1次，测OD600和细胞湿重及留样电泳检测蛋白含量变化。同时监测DO值和发酵液温度并判断甲醇是否过量(停补甲醇观测DO值变化，若停补甲醇后，DO值在1min内上升幅度大于10%，说明碳源受限，反之说明甲醇过量)，若碳源受限，则加快补甲醇的速率，若甲醇过量则应调慢补甲醇的速率，直到合适的速度。
②按照12mL/L比例的PTM1微量元素加入甲醇中，混匀后，以3~4mL·h-1·L-1初始速率加入到发酵罐中诱导表达，DO维持在20~40%之间，以使酵母适应以甲醇为唯一碳源的环境。在此期间，DO值变得不稳定，波动较大，进行通低流氧气，酵母适应以甲醇为唯一碳源的环境后，DO值即保持稳定，继续维持此低速率递增补加甲醇，直到速率达到10~12mL·h-1·L-1，利用通氧量和甲醇补加量的双重优化来保持DO稳定，此过程需要10h。
③补加甲醇的速率恒定为10~12mL·h-1·L-1，DO在30~40%之间，维持20h。 ④补加甲醇的速率增加到16~18mL·h-1·L-1，DO在20~40%之间，维持20h。在此期间，补加高压过的30%饱和度的硫酸铵500mL，补充罐内的氮源，提高表达量。
⑤甲醇诱导50h后，将速率由 16~18mL·h-1·L-1逐级下降，依靠通氧量的优化维持DO在20~40%之间，当甲醇诱导60h，甲醇降至3~4mL·h-1·L-1初始速率，检测菌体湿重达320g/L。
⑥以甲醇3~4mL·h-1·L-1初始速率诱导表达至72h后，检测菌体湿重己接近400g/L，结束发酵。
（7）放罐：
放料操作：发酵结束后，进行放罐。先关搅拌，再关排气阀，调节罐底三向阀至放料位置，利用罐内压力放出料液，用容器接收料液。
（8）发酵罐的清洗与维护：
放料结束后，关闭放料阀及进气阀，打开排气阀，使罐压为0。拆卸罐上的pH、DO等电极以及流加孔上的不锈钢针，并在流加孔和电极插孔上拧上不锈钢塞。自接种孔加入70%清水，启动搅拌，转速100r/min左右，用蒸汽加热至121℃，维持30min，以此清洗发酵罐。清洗完毕，利用空气压力排出洗水，并用空气吹干发酵罐。
关闭空气压缩机及蒸汽发生器电源，通过各个排气阀排出管道内空气及蒸汽，至各压力表显示为0最后关闭所有阀及计算机。