四．蛋白质纯化技术与方法 1.教学目的与要求：
1）了解蛋白质的提取和粗分离。
2）掌握蛋白质的层析分离：离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水和反相层析、亲和层析。
3）掌握蛋白纯化中的衔接技术：蛋白质的浓缩、蛋白质的脱盐、蛋白质生物活性的保持、蛋白质纯化过程中的监测。
3. 教学内容：
分离纯化蛋白质的目的:
①将蛋白质和非蛋白质杂质分离。 ②将不同的蛋白质相互分离。
分离提纯蛋白质的要求：纯度 、活性、得率、速度。 能用作纯化依据的蛋白质性质： 1 大小 2 形状 3 电荷 4 等电点 5 电荷分布 6 疏水性 7 溶解度 8 密度 9 配体结合能力 10 金属结合能力 11 可逆性缔合 12 特异性序列或结构 13 非寻常性质 14 基因工程构建的纯化标记 （1）蛋白质的提取和粗分离：
前处理：
动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织；种子材料应先去壳甚至去种皮以免受单宁等物质的污染，油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理破碎。 粗分级：
当蛋白质提取液（有时还杂有核酸、多糖之类）获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离开来。一般这一步的分级分离用盐析、等
电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大．既能除去大量杂质（包括脱盐），又能浓缩蛋白质溶液。有些蛋白质提取液体积较大，又不适于用沉淀或盐析法浓缩，则可采用超滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法（如聚乙二醇浓缩法）进行浓缩。
（2）蛋白质的细分级分离
一般使用层析法包括凝胶过滤，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法，包括区带电泳、等电聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一般规模较小，但分辨率很高。
结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤。尽管结晶并不能保证蛋白质一定是均一的，但只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白质。由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。 蛋白质的分离纯化方法： 一、根据分子大小不同的纯化方法 1. 透析和超滤
透析—— 只用于除盐类和小分子杂质
透析是利用蛋白质等大分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐单糖等分开。
超滤——除盐和小分子杂质，分离、浓缩蛋白质。 2．密度梯度离心
生物大分子及颗粒的沉降不仅决定于它的大小，而且也取决于它的密度。颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒沉降的快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各自在离心管中被分离成独立的区带。分成区带的样品可以在管底刺一个小孔逐滴放出，分步收集。常用的介质有蔗糖、氯化铯等。 3. 凝胶层析
又叫分子筛层析。分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不同规格。具备条件：1惰性，2水不溶性，3能高度水化。 常用分子筛填料：
1）葡聚糖凝胶（Sephadex）型号：G200、G150、G100、G75、G50、G25、G15，分离大蛋白质、小蛋白质，除盐。
2）琼脂糖凝胶（瑞典Sepharose、美国Bio-GelA）孔径大，用于分离大分子物质。
3）聚丙烯酰胺凝胶（Bio-GelP） 装柱步骤：（同样适用于其它填料） 1.组装柱子。
2.用蒸馏水冲洗以除去末端以及适配器中的气泡。确认在柱床支持处无气泡残留。关掉柱子流出口，保持柱床支持处被水覆盖。
3.重悬介质，单次连续地把填料悬浊液铺在柱管中。用靠在柱管上的玻璃棒引流会尽量减少气泡的引入。
4.如果使用装柱池，迅速将柱子其它空白处和装柱池充满水，将适配器或装柱池的盖子装上，然后将柱子连接到泵上，避免在适配器或入水管中残存气泡。
5.打开柱子底部出口，将泵设置为所需流速。
6.保持装柱流速至少3个柱体积，直到达到一个稳定不变的柱床高度。在柱上标记柱床高度。 7.关闭泵，关上柱子出口。
8.如果使用装柱池，解开装柱池，并把适配器装到柱子上。
9.解开适配器入口，将适配器推进柱子，直到达到标记处。用装柱溶液冲洗适配器入口，锁定适配器位置。
10.将柱子连接到泵或者层析系统上，并开始平衡。如果需要，重新调整适配器。注：在随后的层析过程中，流速不要超过装柱流速的75%。 二、利用溶解度差别的纯化方法 1.等电沉淀和pH控制
蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时，它的溶解度达到最低点。在等电点以上或以下的pH时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而相互排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。不同的蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。
当pH被调至蛋白质混合物中某种成分的等电点pH时，这种蛋白质的大部分或全部将沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中这样沉淀出来的蛋白质保持着天然构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。 2.蛋白质的盐溶和盐析
低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶(salting in),盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。表明中性盐对球状蛋白质的溶解度有显著的影响。 3.有机溶剂分级分离
（1）有机溶剂可以使蛋白质沉淀，常用的有机溶剂主要有乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。
（2）有机溶剂可以破坏水化膜、造成一个低介电区。 （3）有分级分离现象。
（4）要求对有机溶剂低温预冷。 4.温度对蛋白质溶解度的影响
在一定温度范围内，约0-40℃之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加，但也有例外，例如人的血红蛋白从0到25℃，溶解度随温度上升而降低。在40-50℃以上开始变性，一般在中性pH介质中即失去溶解力。大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋白质的分级分离操作一般都在0 ℃或更低的温度下进行。
三、根据电荷不同的纯化方法 1.电泳
2.离子交换层析
离子交换层析的原理是，被分离物质借所带的电荷可与离子交换剂的反电荷结合，在用逐渐增加离子强度的洗脱液洗脱时，离子交换剂上结合的物质可与洗脱液中的离子发生交换而被洗脱到溶液中。由于不同的物质所带的电荷不同，它们与离子交换剂的结合能力也不同，故被洗脱到溶液中的顺序也不同，从而可被分离开来。 层析过程：
1）平衡阶段:离子交换剂与反离子结合。 2）吸附阶段：样品与反离子进行交换。
3）解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质。
4）再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，即可重复使用 离子交换的分类：
离子交换剂是由不溶于水的网状结构高分子聚合物骨架组成，这类不溶性骨架包括树脂、纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等。它们在交换过程中不发生任何反应。在网状结构的骨架上有许多共价结合的带电基团，如侧链带正电的基团，可与带负电的离子相结合，称为阴离子交换剂(anion exchange)（含碱性基团）。如侧链带负电的基团，可与带正电荷的离子相结合，称为阳离子交换剂(cation exchange)（含酸性基团）。具体又可以分为：强阳、弱阳和强阴、弱阴。
（1）强酸性阳离子交换剂：活性基团是-SO3H（磺酸基）和-CH2SO3H（次甲基磺酸基）；
（2）弱酸性阳离子交换剂：活性基团有-COOH，-OCH2COOH，C6H5OH等弱酸性基团；
（3）强碱性阴离子交换剂：活性基团为季铵基团，如三甲胺基或二甲基-?-羟基乙基胺基；
（4）弱碱性阴离子交换剂：活性基团为伯胺或仲胺，碱性较弱。