5．放上待检测的样品，将流式细胞仪设定于RUN，流速可在HIGH 或LOW上。 6．在Acquisiton /Control对话框中，选取Acquire，开始获取细胞。在以下的仪器调整过程中随时选取Pause，Restart以观察调整效果。未完全调整好之前不要去掉SETUP前的“
7．在Detectors/Amps对话框中，调整FSC和SSC探测器中的信号倍增度：PMT voltages（粗调）与Amp Gains（细调），使样品信号出现在FSC-SSC点图内,且三群细胞合理分布。
8．在Threshold 对话框中选择适当的参数设定Threshold，并调整Threshold的高低，以减少噪音信号（细胞碎片）。一般做细胞表型时用FSC－H而做DNA时用FL2－H。Threshold并不影响检测器对信号的获取，但可改善画面质量。 9．从屏幕左列绘图工具中选取Region（区域），并在靶细胞周围设定区域线，即通常所说的门。圈定合适的细胞群可使仪器调整更为容易。
10．在Detectors/Amps对话框中，调整荧光检测器（FL1, FL2, FL3, FL4等）的倍增程度。根据所用的荧光阴性对照样品调整细胞群，使之分布在正确的区域内。 11．在Compensation对话框中，根据所用的调补偿用标准荧光样品调整双色（或多色）荧光染色所需的荧光补偿。比如应该为FL1+ FL2- 的细胞群却分布在FL1＋ FL2＋区域内，则需调大FL2－？％FL1中的“？”，并从FL1-FL2点图中观察新的调整是否恰当
12．在Status对话框中可见：Laser Power:正常值—Run/Ready为14.7mW，Standby为5mW；Laser current:正常值为6Amps左右。
13．调整好的仪器设定可在Instrument Settings对话框中储存，下次进行相同实验时可调出使用，届时只需微调即可。
计算机中已有三个储存于FACStation G3 \\BD? Applications \\CELLQuest Folder \\IMM-InstrSettings及FACStation G3 \\BD Files \\Instrument Settings Files \\CalibFile和Mast-Cell-Set的参数文件，前二者可用于分析人白细胞，后者用于分析小鼠肥大细胞。
四．通过预设的获取模式文件进行样品分析
1．从苹果标志中选择CELLQUEST，新视窗出现后从File指令栏中选择Open，打开预设的获取模式文件。
2．从屏幕上方Acquire指令栏中，选取Connect to Cytometer进行电脑和仪器的连机。将出现的Acquisiton Control对话框移至合适位置。
3．从Cytometer指令栏中选取Instrument Settings，在其对话框中选择Open以调出以前存储的相同实验的仪器设定，按Set 确定。
4．在Acquire指令栏中，选择Acquisition&Storage决定储存的细胞数，参数，信号道数。其中Resolution在做细胞表面标志时选择256，做DNA时选择1024。Parameter Saved…则根据不同的检测对象选择不同的参数。
5．在Acquire指令栏中，选择Parameter Description，以决定文件存储位置(folder)，文件名称(file)，样品代号以及各种参数的标记(panel)，即安排tube1，2，3…的检测参数。一般本仪器获取的数据按照检测对象的不同分别储存于FACStation G3\\BD Applications \\CELLQuest \\IMM 和DNA 文件夹中。文件根据日期命名。 6．在Cytometer指令栏中，选择Counters，将此对话框移至合适位置，以便于随时观察events计数。
7．将样品试管放至检测区，在Acquire Control对话框中选取Acquire以启动样品分析测定。
8．微调仪器设定，待细胞群分布合适后选择Acquire Control对话框中Pause, Abort, ”，开始正式获取信号，存储数据。去除Setup前的“
9．当一定数目的细胞被测定后，获取会自动停止，并会自动存储数据。重复步骤7，继续分析下一个样品，直到所有的样品数据分析完毕。
当所有样品分析分析完毕，即换上三蒸水，并将流式细胞仪置于“STANDBY”状态，以保护激光管。 五．关机程序：
1．从File中选择Quit, 退出软件，选择Don’t Save至苹果屏幕。
2．用4mL 1：10稀释的漂白水作样品，将样品置于旁位（vacuum is on），以外管吸去约2mL，在将样品架置于中位（vacuum is off），再HIGH RUN 5分钟（内管吸去2mL）。
3．改用三蒸水4mL作样品,同上处理。 4．按Prime三次。
5．此时仪器自动转为STANDBY状态，换2mL三蒸水。必须在仪器处于
“STANDBY”状态 10分钟后再依次关掉计算机、打印机、主机、稳压电源，以延长激光管寿命，并确保应用软件的正常运行。
(3)流式细胞技术的样本制备：
石蜡包埋组织样品制备:
1. 将石蜡组织切成50μm厚的组织片3~5片，放入10mL试管中。
2. 加入二甲苯5~8mL，室温下脱蜡1-2天，更换1-2次二甲苯待脱石蜡后，弃二甲苯。
3. 水化：依次加入100%、95%、70%、50%梯度乙醇5mL，每步为10min， 弃乙醇加入蒸馏水3-5mL。
4. 消化：加入2mL 0.5%胰蛋白酶（pH）消化液，置37℃恒温水浴中消化 30min，每隔10min振荡器振荡一次。 5. 加入生理盐水终止消化。
6. 用300 目尼龙网过滤，未消化好的组织可做第二次消化。
7. 收集细胞悬液，离心1500rpm，再用生理盐水漂洗1-2次，离心沉淀，500- 800rpm，去碎片。
8. 根据具体实验目的可标记荧光抗体，或保存细胞备用。 新鲜组织的样品制备：
1. 酶消化法：根据分散组织类型来确定使用的酶类 胰蛋白酶—水解酯键、肽键； 胶原酶—降解几种分子类型的胶原； 溶菌酶—水解糖蛋白、酞的糖苷键； 弹性蛋白酶—消化糖蛋白、弹性纤维。
1）将新鲜组织置于离心管中，加入1-2mL酶消化20-30mL （37℃恒温或室温） 间断振荡或吹打。
2）终止消化，收集细胞悬液，300 目尼龙网过滤，除去细胞团快，低速离心除去细胞碎片。
3）将制备好的单细胞悬液进行荧光标记或保存备用。
注意！酶的使用浓度、消化时间、酶活性的pH值（胃蛋白酶在碱性环境中失去 活性；胰蛋白酶在中性溶剂中活性欠佳等）。
2. 机械法 1）剪碎法：
a.组织快放入平皿，加入少许生理盐水。
b.用剪刀将组织剪至匀浆状，加入10mL生理盐水。 c.用吸管吸取组织匀浆，先以100 目尼龙网过滤到试管中。
d.离心沉淀1000r/min，4-5分钟，再用生理盐水洗3遍， 每次以低速500-800r/min短时离心沉淀去除细胞碎片。
e.300 目尼龙网滤去细胞团块，细胞固定或低温保存备用。 2）网搓法：
a.将100 目、300 目尼龙网扎在小烧杯上。
b.将剪碎的组织放在网上，以眼科镊子轻轻搓组织快，边搓边加生理盐水冲洗，直到将组织搓完。
c.500-800 r/min离心沉淀2min。 d. 固定细胞或低温保存备用。 3）研磨法：
a.先将组织剪成1-2mm3大小组织块。 b.放入组织研磨器中加入1-2mL生理盐水。 c.转动研磨棒研至匀浆。
d.加入10mL生理盐水，冲洗研磨棒。
e.收集细胞悬液，经300 目尼龙网过滤，离心沉淀500-800r/min，1-2min，再以生理盐水洗3遍，离心沉淀。 f. 固定或低温保存备用。
机械法特点：易造成细胞碎片和团快，常与其他方法（如酶消化法）配合使用。 3. 化学处理法
作用原理：将组织细胞间起粘着作用的钙、镁离子置换出来，从而使细胞分散开来。
1）将组织切成薄片置入试管中，加入EDTA液5mL，室温0.5h，离心弃之。 2）加入胰酶-EDTA液5mL，37℃恒温水浴振荡器内30min。
3）300 目尼龙网过滤，离心沉淀1000r/min，5min，再以生理盐水洗2-3次。
4）细胞固定或低温保存备用。
特点：用化学法细胞存活率低、细胞产额低、细胞碎片和聚集量不稳定。 培养细胞的样品制备：
1. 将培养细胞用0.04% EDTA-2Na或0.29%胰蛋白酶消化3-7分，至光镜下见到贴壁细胞间出现筛状间隙为止，弃去消化液，加PBS液。 2. 用吸管将细胞从瓶壁上轻轻吹打下来，并移入离心管中。 3. 短时低速离心，即800-1000r/min，5min。
4. 弃上清，加pH7.4的PBS液5-8mL，低速短时离心，800- 1000r/min离心3-5min，重复2-3次，以去除细胞悬液中的细胞碎片。
5. 加少许PBS液，将沉淀细胞轻轻吹打均匀，加固定液或低温保存备用。 外周血单个核细胞样本制备：
1. 取肝素抗凝外周血2mL，用生理盐水将血稀释成4mL混匀。
2. 将稀释后的血沿试管壁缓慢加入4mL淋巴细胞分离液Ficoll到液面上（勿用力过大以免造成血液与分离液混合），保持清晰的分层状态。
3. 离心2000r/min，30min，室温18-20℃，离心后可见试管内血液清楚地分4层，上层为血浆，中层为分离液（单个核细胞处于血浆层和分离液层之间），底层为红细胞，红细胞上为粒细胞。
4. 用吸管将上层与中层之间的单个核细胞层吸出到另一个管中，用生理盐水洗2遍，每次均以1500r/min，离心10min，弃上清即得到高纯度的单个核细胞悬液。 5. 用适当的固定液固定或低温冰箱中保存备用。 流式分析样本的制备： 1. 单细胞悬液的制备
2. 目的分子标记：最好选用直标抗体，即抗体-荧光素，标记后用PBS洗2-3次。3. 样本过滤等待上机：标记好的单细胞样本重悬至106个/毫升、300-500微升的总体积，再用300 目的滤网过滤至5毫升流式管中等待上机。也可用1-2%的多聚甲醛等固定，24小时内上机测试。 流式分选样本的制备 ：
1. 样本制备的所有过程要在细胞培养间完成。
2. 样本制备过程中所需试剂均需做无菌处理：如胰酶、抗体类需用milipore的
0.2μm滤器过滤，PBS等缓冲液需高压灭菌，所有器械、容器均需高压灭菌等。 3. 样本制备完毕后需用无菌PBS重悬至107—108个/毫升，用400目筛网（经过高压灭菌处理）过滤至5毫升无菌流式管中密封后准备上机。娇气的细胞可加入≤2%的血清保持细胞活性。
4. 样本收集管可采用5毫升无菌流式管、15毫升离心管、6—96孔板等。 为了保持细胞活性，收集容器中可加入适量纯血清或完全培养基等备用。 5. 制备好的样本及收集容器密封好后最好放在冰盒上待用。
参考文献
(1)颜真，张英起编著，《蛋白质研究技术》，第四军医大学出版社，西安，2007. (2)陈志南编著，《细胞工程》，科学出版社，北京，2006. (3)张星元编著，《发酵原理》，科学出版社，北京，2005.
(4)吴后男编著，《流式细胞术原理与应用教程》，北京大学医学出版社，北京，2010.