第1章 绪论
糖、半乳糖和阿拉伯糖等单糖；二糖有芸香糖、2-葡糖-β-葡糖苷、龙胆二糖与昆布二糖等；三糖有时也可与花色素结合。其中3位羟基上结合糖可为单糖、二糖或三糖，5位和7位结合的多为单糖。甲氧基化多在B环的3位和5位。多羟基存在使花色苷的稳定性不如多甲氧基高，其稳定性随着糖配基羟基化程度增加而下降，甲氧基化程度增加而上升[5]。
而被酰基化的花色苷稳定性会更高。与其发生酰化作用的有机酸主要为：肉桂酸、阿魏酸、p-香豆酸、咖啡酸等有机酸。 一般结合在花色素的3位糖上，或者在3位和5位糖上结合2个酸。
1.2.2 花色苷的提取、纯化、结构鉴定和含量测定
1. 花色苷的提取
(1) 溶剂萃取法：此法是国内提取花色苷最常用的方法。先用有机溶剂浸提，在经过过滤、减压浓缩、真空干燥精制等工艺得到最终产品。常用的提取溶剂有水、酸碱溶液，有机溶剂如乙醇、甲醇、丙酮、烷烯烃、苯等。丁九斤[6]等研究了醋酸溶液提取蓝莓花色苷，提取率可以达到92.8％。赵慧芳[7]等用1％HCl-甲醇提取黑莓果实花色苷，提取90min，能够达到很显著的效果。
(2) 超声波辅助萃取法（Ultrasonic-Assisted Extraction，UAE）：超声波是指频率为20千赫～50兆赫的电磁波，是利用超声波辐射压强产生的强烈空化效应、扰动效应、高加速度、击碎和搅拌作用等多级效应。增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透率，从而加速目标成分进入溶剂，促进提取的进行。与常规的萃取技术相比，超声波萃取技术快速、价廉、高效[8]。孟凡丽等[9]比较了超声波法和热浸提法对越橘果实花色苷的提取，表明超声波法提取液颜色深，花色苷含量高，提取率也高。朱洪梅等[10]对超声波辅助提取紫甘薯花色苷的工艺进行了研究，确定最佳提取工艺为：提取温度70℃，提取时间40min，料液比1：10。M.Corrales等[11]比较了超声波法、高静水压技术（high hydrostatic pressure, HHP）和脉冲电场法（pulsed electric fields, PEF）提取葡萄花色苷，显示超声波法比一般方法效率高3倍。Fang Chen等[12]研究了超声波辅助法提取红木莓花色苷最优工艺条件，结果表明其料液比为1：4，提取时间200s，功率400W，提取率大概为78.13％。
(3) 微波辅助萃取法（Microwave-assisted extraction, MAE）：微波萃取是利用微波能来提高萃取效率的一种较新技术。微波是一种频率300～300000MHz的电磁波。在微波场中吸收微波能力的差异使得基本物质的某些区域或萃取系统中的某些组分被吸收加热，从而使得被萃取物质从基体或体系中分离，进入到介
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电常数较小、微波吸收能力相对较弱的萃取剂中。具有设备简单、适用范围广、重现性好、萃取效率高、萃取时间短、能耗低、污染小等特点[13]。
余红英等[14]研究了微波提取木棉花色素的工艺，微波功率为750W、辐射时间90s、固液比1：60(W/V)。Sun等[15]研究了利用微波辅助提取法提取红木莓花色苷的工艺，其料液比4：1(mL/g)，提取时间12min，功率366W。
(4) 酶法提取：酶法提取在食品工业中应用广泛，酶处理可使细胞壁发生不同程度改变，如软化、膨胀和崩溃等，从而提高细胞内含物提取率。如应用于果蔬榨汁、花粉饮料有利于细胞内物质渗出、增加出汁率约10％、减少压榨压力、促进汁液榨取和澄清作用[16]。李颖畅等[17]用纤维素酶、果胶酶及二者复合对蓝莓果中花色苷进行了提取，发现纤维素酶提取效果好。其酶用量5mg/g、料液比1g:8ml、pH5.0、提取时间60min、酶解温度45℃、提取2次，证明蓝莓果中花色苷含量约为350mg/100g鲜果。赵玉红等[18]用酶法和超声波法联用提取蓝靛果果渣中的花色苷，发现其比酶解法得率高5.12％，比超声波法高17.44％。B.B.Li.Smith等[19]研究了酶法辅助提取5种柑橘属果皮中多酚类物质，发现柚子果皮中多酚含量最高。
(5) 超临界流体萃取（Supercritical Fluid Extraction, SFE）：是食品工业新兴的一项萃取分离技术。其原理是利用处于临界温度、临界压力之上的超临界流体具有溶解许多物质的性质，将其作为萃取剂，从液体或固体萃取分离出特定成分的新型分离技术[20]。近年，人们尝试将SFE技术应用于天然色素萃取。张树宝
[21]
研究了超临界CO2萃取大花葵花色苷的工艺，得出最佳萃取工艺参数：萃取
压力25Mpa、萃取温度60℃、萃取时间45min、物料比1：25时萃取率最高，为0.681％。Tünde Vatai等[24]使用超声波法提取了接骨木果和不同葡萄果渣中的多酚类化合物。
2. 花色苷的纯化
(1) 柱层析法（Column Chromatography,CC）：柱层析法又称为柱色谱法，是将待分离物质均匀地加在装有固定相的柱子中，再加入适当的溶剂冲洗，由于固定相和移动相相对各组分的亲和力不同，试样中各组分在两相中的分配不同，在柱中随流动相移动的速度不同，对固定相亲和力最弱的组分随洗脱剂首先流出，通过分段定量收集洗脱液而使各组分得到分离[23]。目前大多采用凝胶、聚酰胺、硅胶、离子交换树脂、大孔树脂等[24]。
1 大孔吸附树脂法：大孔吸附树脂法是利用大孔吸附树脂对欲分离物质的○
吸附作用和筛选作用达到分离目的的方法。其以大孔树脂为固定相，是天然物提取液的有效成分有选择性的吸附在树脂上，而杂质部分不被吸附，在经适当的溶
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液洗脱，收集有效成分的洗脱液，合并浓缩，回收溶剂，达到分离提取液中有效成分的目的。是分离天然产物化学成分如皂苷、生物碱、黄酮、香豆素及花色素的新工艺[23]。目前国内，有利用树脂法纯化紫玉米、蓝莓果、黑大豆、黑加仑果渣、黑米、荔枝果皮和血橙花色苷等研究[25-31]。Zhang等[32]用XAD-7树脂纯化荔子果皮花色苷，发现其对荔子花色苷的亲和力很高。Dietmar Kammerer等[33]同样用XAD-16 HP树脂纯化葡萄果渣提取物中的花色苷，可以达到96％-100％的总花色苷。
2 凝胶柱层析：凝胶柱层析也称排阻层析，工作原理是利用具有网状结构○
凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。层析柱的固定相多是交联的多聚糖（如葡聚糖或琼脂糖），小分子物质能进入其内部，洗脱下来的速度慢，而大分子物质却被排除在外部，洗脱下来的速度快，当混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量分开了[24]。曹少谦等[31]对大孔树脂NKA-9分离的血橙花色苷再次用Toyopearl TSK-40S柱层析进一步纯化，得到了3个单一花色苷和1个混合花色苷。Zhang等[32]对树脂纯化的荔子果皮花色苷用交联葡聚糖LH-20柱层析法进行进一步的纯化，分离出来了4种花色苷。
3 聚酰胺层析法：聚酰胺是一类纤维树脂，分子链上的重复结构单元是酰○
胺基的聚合物。其原理是根据“氢键吸附”，即当所分离化合物的结构与聚酰胺形成氢键的能力越强时，其吸附也就越强，也就越难洗脱。此法在花色苷中应用不多，主要用于黄酮类化合物的分离纯化[24]。
4 硅胶层析法：硅胶层析法的原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得○
到分离，其中有微孔，对不同化合物的吸附能力不同，然后选用适当的洗脱剂进行洗脱从而达到分离目的[24]。唐克华等[34]研究表明以1.8％羧甲基纤维素钠（CMC）制备的硅胶G薄板最适宜红檵木花色素的层析分离，展层剂“水：乙醇：正丁醇：乙酸乙酯”的体积比为11:8:30:36时的分离效果最佳，共分离检测出7种水溶性花色素成分。
5 离子交换树脂法：离子交换树脂法依据的原理是物质的酸碱性、极性，○
也就是所带阴阳离子的不同。电荷不同的物质，对管柱上的离子交换剂有不同的亲和力，改变冲洗液的离子强度和pH值，物质就能依次从层析柱中分离出来
[24]
。胡隆基等[35]报道葡萄果汁和葡萄皮色素用磺酸型阳离子交换树脂进行纯(2) 膜分离法：膜分离法是用天然或人工合成的高分子膜，以外界能量或化
化，可除去浓缩液中的糖及有机酸，精制后的产品中色素的稳定性得到提高。 学位差为推动力，对混合物进行分离、分级、提纯和浓缩的方法，统称为膜分离
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法[23]。花色苷提取中常用的膜分离技术有超滤(UF)、反渗透(RO)、电渗析(ED)等[24]。Barbara Gilewicz-Lukasik等[36]研究了纳米膜纯化野樱莓花色苷，发现亚硫酸钠不仅是好的提取剂而且提高了膜过滤的效率。
(3) 高速逆流色谱（High Speed Countercurrent Chromatography, HSCCC）技术是由美国国立健康研究院的Ito教授发明研制，是一种无固体载体的连续液体色谱技术。HSCCC利用单向流体动力学平衡原理，使2个互不相容的溶剂相在高速旋转的螺旋管中单向分布，其中一相作固定相，由恒流泵输送载有样品的流动相穿过固定相，利用样品在两相中分配系数的不同实现分离[3]。Degenhardt等
[37]
用装有3个螺旋管柱的CCC-100高速逆流色谱仪分离XAD-7纯化过的黑加仑
提取物，得到了4种花色苷。Du等[38]用一台柱容量364mL的高速逆流色谱仪分离了越橘中的花色苷，得到了飞燕草色素-3-O-β-d-葡萄糖-β-d-木糖苷和矢车菊色素-3-O-β-d-葡萄糖-β-d-木糖苷。
(4) 重结晶法：从非结晶状物质处理到结晶状物质，叫结晶。从比较不纯的结晶用结晶方法精制到较纯的结晶为重结晶[23]。向色素溶液中加入质量分数5％醋酸铅，使色素沉淀，再将沉淀用盐酸酸化的乙醇溶解形成氯化铅白色沉淀，过滤除去白色沉淀得到纯度较高的花色苷溶液。由于醋酸铅剧毒，所以此法不适用于食用天然色素的生产[24]。
3. 花色苷结构鉴定
花色苷种类很多，现在已经发现的就有400多种，而且每年都不断有新的发现。花色苷鉴定技术的发展对其结构、理化性质和生理功能的研究及其新资源的开发和指导生产有很大的意义。目前的鉴定方法主要有层析法、光谱法、质谱法、核磁共振、毛细管电泳及水解法等。
(1) 纸层析（Paper Chromatography, PC）：也称为纸色谱，是以纸为载体的液相色谱法。早在1944年由Martiu和Synge发现，当时主要用于分析氨基酸，目前多用于亲水化合物的分离[23]。根据花色苷在不同溶剂中的迁移值(Rf)和颜色来判断花色苷的类别。叶兴乾等[39]用层析法鉴定出了荸荠种杨梅果实中的花色苷为矢车菊花色苷苷元及其他5种微量苷元。
(2) 薄层层析（Thin-Layer Chromatography, TLC）：又称薄层色谱，1938年N.A.Izmailor和M.S.Schraiber首次在显微镜载玻片上涂布氧化铝薄层，用微量圆环技术分离了多种植物酊剂中的成分，形成了应用广泛的薄层色谱法[23]。原理与纸层析相同，也可采用与纸层析法相同的展开剂。杨朝霞[40]发现展层剂BAW效果最好，鉴定出了紫甘薯中3个组分的花色苷。
(3) 紫外-可见光谱法和红外吸收光谱法：紫外-可见光谱法很早就用于花色
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苷的结构鉴定。色素的紫外吸收光谱是色素的重要特征。吸收光谱是鉴定和测量混合物中主要色素的最简单方法。其主要原理是依据花色苷的不同基团在不同波长下有不同的吸收峰，进而推断出其结构。而红外光谱目前在花色苷结构鉴定中的报道不多。花色苷的红外光谱主要有苯环、含氧杂环、糖和羟基及其甲氧基四部分[24]。
(4) HPLC、MS、HPLC-MS：高效液相色谱法（High Prformance Liquid Chromatography, HPLC）是在液相色谱中，采用颗粒十分细的高效固定相，并采用高压泵输送流动相，全部工作通过仪器来完成，对有机物进行分离分析的方法。主要特点：高压、高选择性、高灵敏度和高速[23]。Kammerer等[33]采用HPLC从葡萄果渣中鉴定出了14种花色苷。
质谱法（Mass Spectrometry, MS）是通过对被测样品离子的质荷比的测定来进行分析的一种方法。被分析的样品首先要离子化，然后利用不同离子在电场或磁场的运动行为不同，把离子按质荷比分开而得到质谱，通过样品的质谱和相关信息，可以得到样品的定性定量结果[24]。杜琪珍等[41]用ESI-MS得到了2种主要花色苷单体的结构，其分别为：矢车菊色素-3-β-吡喃葡萄糖苷和飞燕草色素-3-葡萄糖苷。
HPLC-MS在花色苷鉴定中应用最广泛。Zhang等[32]用此法鉴定了荔枝果皮中的6种花色苷，主要是矢车菊色素-3-芸香糖苷。Sun等[12]利用HPLC-MS鉴定出红树莓中12种花色苷。
(5) 核磁共振法（Nuclear Magnetic Spectroscopy, NMR）：核磁共振法是有机结构鉴定的重要手段之一，广泛应用于天然产物的鉴定。Maurizio Fiorini[42]用NMR鉴定了草莓、接骨木果、茄子和萝卜中的花色苷。
(6) 毛细管区带电泳法（Capillary Zone Electrophoresis, CZE）：CZE是采用熔合二氧化硅毛细管，将分离溶剂调到一定pH值，花色苷在CZE中的迁移时间顺序取决于分子电荷和分子大小的比率，以及缓冲液复杂化合物的形式。因此，不同的花色苷接在覆盖有线性聚丙烯酰胺的毛细管壁上分离[24]。
4. 花色苷含量的测定
目前总花色苷的定量方法有很多，而花色苷单体多采用HPLC法。 (1) 单一PH值法：花色苷的最大吸收区在500～540nm范围内，在新鲜的植物提取液中在最大吸收区很少含有干扰物质，因此花色苷总量可以根据比尔定律通过适当的吸光值来测定。该方法需要在恒定的pH值介质中进行，一般用平均比消光系数（avE）来测定花色苷总量，误差小于0.2％[43]。陈炳华等[44]用该方法测定了吕宋荚迷果中花色苷的含量。
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