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y = -1.5492x + 130.03(R2 = 0.9703 n=55)白色绿色浅粉色粉红色粉蓝色红色紫色红紫色红黑色a*60.050.040.030.020.010.00.0-10.0-20.00.010.020.030.040.0y = -0.5456x + 61.843(R2 = 0.6067 n=30)50.060.070.080.090.0100.0L*
白色绿色浅粉色粉红色粉蓝色红色紫色红紫色红黑色b*50.040.030.020.010.00.0-10.0-20.0-30.00.010.020.030.040.050.060.070.080.090.0100.0y = 0.6386x - 47.405(R2 = 0.8653 n=71)L*
y = -1.0227x + 98.15(R2 = 0.8519 n=55)白色绿色浅粉色粉红色粉蓝色红色紫色红紫色红黑色C*60.050.040.030.020.010.00.00.020.040.0y = -0.5878x + 67.0892(R = 0.714 n=30)60.080.0100.0L* 图2-3 中原牡丹CIE L*a*b*表色系统的花色测定值之间的关系
Fig. 2-3 Relationship between CIE L*a*b* coordinates of petal colols Zhangyuan tree peony
cultivars
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第2章 牡丹花色测定及其表型分析
2.4 结论
94个中原牡丹品种花色在CIE表色系统坐标系上的分布广泛，聚类分析将其分为9个色系：白（20种）、绿（1种）、浅粉（8种）、粉红（13种）、粉蓝（12种）、红（14种）、紫（11种）、红紫（7种）、红黑（8种），不同色系牡丹的L*、 a* 和b*值特征明显。白、浅粉、粉红和红色系以及粉蓝、紫和红紫色系的L*与a*、L*与彩度（C*）均表现出显著的负相关性（L*与a*的相关系数R2分别为0.9703和0.6067，L*与C*的相关系数R2分别为0.8519和0.714）；多数色系牡丹（除红和红黑外）的L*与b*呈显著的正相关关系（R2为0.8653）。
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第3章 HPLC法检测牡丹花色苷种类与含量
第3章 牡丹花色苷的种类与含量
3.1 引言
花色素是花色形成的物质基础。牡丹花色素属于类黄酮化合物，主要有花色苷、黄酮和黄酮醇的苷类[57,61,62]。本实验室已利用高效液相色谱与二极管陈列检测器和电喷雾电离质谱联用技术（HPLC-DAD-ESI-MS）分离鉴定了少数几个品种牡丹花中的花色苷类化合物[63]，分别为矢车菊色素-3, 5-O-二葡萄糖苷（Cy3G5G），矢车菊色素-3-O-葡萄糖苷（Cy3G）、芍药色素-3, 5-O-二葡萄糖苷（Pn3G5G）、芍药色素-3-O-葡萄糖苷（Pn3G）和天竺葵-色素3, 5-O-二葡萄糖苷（Pg3G5G）。
本章采用HPLC-DAD-ESI-MS方法检测了不同色系48个中原牡丹品种的花色苷的含量和种类，分析了不同色系牡丹花色苷含量和各单体花色苷相对丰度的特点；并结合第2章的花色测定结果，分析了牡丹花色与花色苷含量和种类的关系，为牡丹花色育种以及牡丹资源的综合开发提供科学依据。
3.2 材料与方法
3.2.1 材料、仪器与试剂
实验材料：牡丹花采自洛阳市土桥花木种苗有限公司和国家牡丹园。按花期不同，采集时间分别为：2009年4月10日和2009年4月18日。共8个色系48个品种，品种名及编号见表3-1。
主要设备：HH-4恒温水浴锅（江苏金坛市亿遍电子有限公司），FA/JA电子天平（上海上平仪器公司），101-2A电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司），RE-52旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），SHB-Ш型循环水式多用真空泵（陕西鹏展科技有限公司），PHS-3C型精密pH计（上海金鹏分析仪器有限公司），SY3200-T超声波清洗仪（上海生源仪器设备有限公司），高效液相色谱-质谱联用仪(Waters 2690)、Waters 996 DAD（美国Waters公司）、Amberlite XAD-7(美国罗门哈斯公司)。
主要试剂：矢车菊色素-3-O-葡萄糖苷为Sigma公司产品，甲醇、乙酸乙酯、盐酸等以及其他试剂均为国产分析纯。
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3.2.2 实验方法
(1) 花色苷提取
采摘盛花期的牡丹花，去柄去蕊，称取鲜嫩完好的花瓣1 g，剪碎，加入25 mL无水甲醇，避光4℃浸提12 h。3000 r·min-1离心5 min，取上清液，为牡丹花色苷提取液。
(2) 牡丹花色素提取液中花色苷含量的测定
色谱柱：Waters Sunfire C18 （2.1×150mm，5μm）；流动相A液：1％乙酸，B液：甲醇。线性梯度洗脱：0?20 min, B液0?80%；20?30 min, B液80?100%。流速：0.3 mL·min-1。柱温35 ℃，进样量20 μL。DAD检测器，花色苷检测波长520nm。 质谱条件：正离子扫描（ESI+，m/z 100-1000），毛细管电压：3.8kV；锥孔电压：30V；光电倍增器电压：650V；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：300℃；检测分流比1：5。根据各色谱峰的紫外吸收光谱、质谱、保留时间等信息，结合文献报道，并与标准品相对照，确定具体花色苷的种类，详见参考文献[63]；并采用峰面积归一化法[61,62,64]计算不同品种牡丹花瓣中所含不同种类花色苷的相对丰度。花色苷总量测定以矢车菊色素-3-O-葡萄糖苷为标样，采用外标法定量。
3.2.3 数据分析
利用SAS软件(9.0版本)，结合第2章测定的牡丹花色的数据和本章花色苷种类和含量的几个变量，分析表示牡丹花色的三刺激值与花色苷测定值之间的相关性，研究牡丹花色与花色苷之间的关系。
3.3 结果与分析
3.3.1不同色系中原牡丹花色苷总含量和组成分析
花色是牡丹重要的观赏性状之一，而花色素则是牡丹花色形成的物质基础。牡丹花色素属于类黄酮化合物，主要有花色苷、黄酮和黄酮醇的苷类[57,61,62]。本实验室已利用高效液相色谱与质谱联用技术分离鉴定了少数几个品种牡丹花中的花色苷类化合物[63]。本章选取48个中原牡丹品种，包括白（8种）、黄（5种）、粉红（6种）、粉蓝（6种）、红（12种）、紫（5种）、红黑（3种）、红紫（3种），采用高效液相色谱与质谱联用方法分别对48个中原牡丹品种的花色苷进行了分析鉴定，测定了花色苷的总含量，并采用峰面积归一化法计算不同品种所含各花色苷单体的相对丰度，结果见表3-1。
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第3章 HPLC法检测牡丹花色苷种类与含量 表3-1 不同品种中原牡丹的花色苷总含量、花色苷单体相对含量1
Table 3-1 Totle anthocyanin content and relative abundance of individual anthocyanins of different cultivars of Zhangyuan tree peony1
Cy Pg Pn Cy Pg Pn 3G5G 3G
品 种
3G5G 3G 3G5G 3G 3G5G 3G
白鹤卧雪 白雪塔 白玉 冰壶献玉 凤丹白 三变赛玉 香玉 玉楼点翠
平均值 标准差
池塘小月 黄金轮 金玉交章 中秋月光 种生黄
平均值 标准差
彩绘 4.90 - - - 90.50 4.60 4.90 - 95.10 95.40 4.60 苓花沾露 6.14 - - - 90.5 3.36 6.14 - 93.86 96.64 3.36 胜葛巾 5.26 - 6.56 - 83.98 4.2 5.26 6.560 88.18 95.80 4.20 雁落粉荷 13.22 - 3.54 - 83.24 - 13.22 3.54 83.2 100 -
花色 白色2
黄色2 粉蓝色
TA (×100) 0.03 0.20 0.03 0.07 0.18 0.35 0.00 0.00 0.11 0.13 0.47 0.00 0.25 0.12 0.24 0.22 0.18 1.69 3.00 1.19 3.95
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