第3章 HPLC法检测牡丹花色苷种类与含量
表 3-4 PnCy类牡丹花花色与花色苷的回归分析
Table 3-4 The regression analysis between flower colors and anthocyanins in PnCy tree peony
花色与花色苷 L*与TA L*与花色苷单体 a*与TA a*与花色苷单体 b*与TA b*与花色苷单体
回归方程
L*＝70.0817－1.9047TA
L*＝78.4913+21.9470Cy3G5G－8.2603Pn3G5G a*＝21.1583+0.86799TA
a*＝15.2665-15.8373Cy3G5G+5.2436Pn3G5G b*＝-8.0343-0.2211TA
b*＝-4.4911+6.0363Cy3G5G-70.1124Pg3G5G-15.2324Pn3G
R2 0.7123 0.9086 0.3646 0.6086 0.0831 0.5955
显著性 0.0011 0.001 0.0492 0.0236 0.3899 0.0810
表 3-5 PgPn类牡丹花花色与花色苷的回归分析
Table 3-5 The regression analysis between flower colors and anthocyanins in PgPn tree peony
花色与花色苷 L*与TA L*与花色苷单体 a*与TA a*与花色苷单体 b*与TA b*与花色苷单体
回归方程
L*＝76.3556-3.4335TA
L*＝76.8219-3.6271Pg3G5G-54.4062Pn3G5G a*＝18.2623+4.2488TA
a*＝16.28869+5.3233Pg3G5G+40.4808Pn3G b*＝0.5042-0.3297TA
b*＝-0.9815+0.3871Pg3G5G-29.5594Pn3G
R2 0.9804 0.9821 0.8668 0.9336 0.0645 0.4724
显著性 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.4791 0.1067
3.4 结论
采用高效液相色谱与二极管陈列检测器和电喷雾电离质谱联用技术（HPLC-DAD-ESI-MS）分析了48个品种的中原牡丹花瓣中的花色苷总含量、种类以及各花色苷单体的相对丰度。结果表明：中原牡丹花中共含有基于天竺葵色素、芍药色素和矢车菊色素的五种花色苷，分别为矢车菊色素-3,5-O-二葡萄糖苷（Cy3G5G），矢车菊色素-3-O-葡萄糖苷（Cy3G）、芍药色素-3,5-O-二葡萄糖苷（Pn3G5G）、芍药色素-3-O-葡萄糖苷（Pn3G）和天竺葵色素-3,5-O-二葡萄糖苷（Pg3G5G），不含天竺葵色素-3-O-葡萄糖苷（Pg3G）。48个品种中原牡丹花色苷总含量变化范围为0~289.5mg/100g；不同色系牡丹花色苷单体的相对丰度差异显著，粉色和红色系品种以天竺葵素-3,5- O-二葡萄糖苷为主（相对丰度分别为88.09%和 79.06%），粉蓝色、紫色和红黑、红紫色系以芍药花素-3, 5- O-二葡萄糖苷为主（相对丰度分别为88.35%、82.19%和 75.65%、72.74%），矢车菊类色素在红紫和红黑色系牡丹中的相对丰度较大。
无论PnCy类还是PgPn类牡丹花，牡丹花色的亮度值L*与花色苷总量(TA)具有负相关性。在PnCy类中花色色度值a*和b*都与TA没有相关性，主要是因
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为不同的花色苷单体对花色影响不一致引起的。PgPn类牡丹花的a*值与花色苷总量(TA)正相关，因为主要影响牡丹花色的两种花色苷单体均与a*值具有正相关性。
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第4章 大孔吸附树脂法纯化牡丹花色苷工艺研究
第4章 大孔吸附树脂法纯化牡丹花色苷工艺研究
4.1 引言
大孔吸附树脂(Marcroporous Resin)是六十年代末发展起来的一类有机高聚物吸附剂，同时兼有吸附性和筛选性，是以吸附作用和筛选作用相结合的分离材料，其吸附作用是由于范德华力或产生氢键的结果，而筛选作用则是由树脂本身的多孔性结构所决定。大孔树脂可分为非极性、中极性和极性三大类。根据分离物质极性的大小，通过选择与之相适应的树脂达到分离与纯化的目的。目前大孔树脂在分离纯化天然产物方面的应用越来越广泛，如纯化黄酮、生物碱、多酚、花色苷等都有报道[66,67,68]。
目前为止，还未见通过大孔吸附树脂法纯化牡丹花花色苷的报道。本章研究了大孔吸附树脂纯化中原牡丹花色苷的特性，以期找到分离纯化牡丹花色苷的最佳树脂及纯化花色苷的工艺，为进一步开发利用牡丹资源提供科学依据和理论支持。
4.2 材料与方法
4.2.1 实验试剂和仪器
实验试剂：不同型号的大孔吸附树脂（厂家型号见表4-1），甲醇、石油醚、乙酸乙酯、盐酸、乙醇、乙酸钠、氯化钾等均为国产分析纯，蒸馏水自制。
主要仪器：RE-52旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）, HL-2恒流泵（上海沪西分析仪器厂有限公司），BSZ-100电脑自动部分收集器（上海精科实业有限公司），722N可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）， PHS-3B型精密pH计（上海精密科学仪器有限公司），QYC-2102C上海福玛全温空气摇床（上海福玛实验设备有限公司），FA/JA电子天平（上海上平仪器公司）。
实验材料：牡丹花采自洛阳市土桥花木种苗有限公司，选择花色较深且种植范围较广的牡丹品种‘洛阳红’来进行研究。 4.2.2 实验方法
(1) 花色苷提取液制备
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河南科技大学硕士学位论文
新鲜的牡丹花瓣用0.1% HCl甲醇溶液提取，提取液减压浓缩；浓缩液先用石油醚萃取，除去脂溶性杂质，萃取液放冰箱中备用；使用前用缓冲液稀释至所需浓度。
(2) 花色苷浓度的测定
花色苷含量测定采用pH示差法。取0.5mL待测液，分别用pH1.0 KCl缓冲液（125mL, 0.2MKCl：375mL, 0.2MHCl）和pH4.5醋酸钠缓冲液（400mL, 1MNaAc：240mL, 1MHCl：360mL, H2O2）稀释至5mL，室温下静置120 min，分别测定它们在520nm和700nm处的吸光值，根据朗伯/比尔定律, 参考Fuleki T的经验公式就可以测得花色苷的含量[69]。计算公式如下[70]：
花色苷浓度(mg/L)?A?MW?DF?1000 (式4-1)
ξ?1A=(Aλ520-Aλ700)pH1.0-( Aλ520-Aλ700)pH4.5 (式4-2)
式中，A为吸光值（其计算方法见式4-2）；MW＝449.2（为矢车菊色素-3-O-葡萄糖苷的分子量）；DF为原样的稀释倍数；ξ＝29600，为矢车菊色素-3-O-葡萄糖苷在520nm的平均分子摩尔消光系数。
(3) 树脂预处理
20种不同型号的大孔吸附树脂（物理性质及编号见表4-1），乙醇浸泡24h，充分溶胀后用乙醇 洗涤，至洗涤液加适量蒸馏水无白色混浊现象，然后用蒸馏水洗至无醇味[71]。
表 4-1 不同型号大孔吸附树脂的物理性质 Table 4-1 Physical properties of macroporous resins
极性 粒径/mm 比表面积/m2·g
极性 极性 极性 极性 极性 极性 中极性 中极性 中极性 中极性 中极性 中极性 中极性 弱极性 弱极性
0.3-1.25 0.35-1.25 0.3-1.25 0.3-1.25 0.3-1.2 0.35-1.25 0.3-1.25 0.35-1.25 0.3-1.2 0.3-1.25 0.3-0.9 0.25-1.25 0.25-1.25 0.3-1.25 0.3-1.25
250-290 550-600 ≥150 540-580 550-600 ≥550 500-550 380-500 500-550 ≥330 450 400-600
- 480-520 ≥400
树脂名称
南开化工NKA-9 西安蓝深LS-45 天津大均D-201 南开化工D-4020 沧州宝恩HPD-600 安徽三星D-1300 沧州宝恩DM130 西安蓝深LSA-10 沧州宝恩HPD-400 天津大均D-301 Amberlite XAD-7 南开化工D-101 西安蓝深LSA-40 沧州宝恩AB-8 天津大钧D-101
平均孔径/nm 15.5-16.5
- 80.9 10-10.5 80 - 90-100 8.5-9 75-80 33.5 45-50 10.0-12.0
- - 93.1
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第4章 大孔吸附树脂法纯化牡丹花色苷工艺研究
续表 4-1 Continued 4-1 粒径/mm 0.35-1.25 0.3-1.25 0.3-1.25 0.3-1.25 0.3-1.25
树脂名称
西安蓝深LS-303 天津大钧D-401 安徽三星X-5
沧州宝恩HPD-826 沧州宝恩ADS-17 极性 弱极性 弱极性 非极性 氢键 氢键
比表面积/m2·g 500-700 ≥480 500-600 500-600 90-150
平均孔径/nm
- - 29.0-30.0 90-10 25-30
(4)静态吸附及解吸实验 ① 树脂筛选
花色苷提取液用pH2.6磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释10倍，得到浓度为0.141mg·mL-1花色苷样品液，备用。准确称取20种型号的湿树脂各3g，置于250mL三角烧瓶中，各加30mL花色苷样品液，置于水浴摇床上，25℃、120r·min-1振荡12h，抽滤，再各用30mL 90％乙醇于25℃、120r/min摇床上振荡12h，洗脱各树脂吸附的花色苷，过滤。分别测定滤液及洗脱液中花色苷的含量，计算各树脂的吸附量、吸附率及解析量、解析率（吸附量和吸附率参照式4-3和式4-4）。
Q1?D?C2?V2 (式4-5) mC2?V2?100 (式4-6)
(C0?C1)?V1式中，Q1为解析量，mg·g-1；C2为解析液中花色苷浓度，mg·L-1；V2为解析液体积，L；D为解析率，%。
② 上样pH值的测定
准确量取牡丹花提取液5mL，花色苷浓度为1.141mg·mL-1，8份，分别用pH值2.2、2.6、3.0、3.4、4.0、4.4、5.0、6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（缓冲液配置见表4-2）稀释至50mL（稀释前后样液pH变化很小，可忽略不计），备用。称取某一种吸干表面水分的湿树脂（南开化工D-101）3g，8份，分别置于250mL三角烧瓶中，各加入不同pH缓冲液稀释的提取液30mL，置于水浴摇床上，25℃、120r·min-1振荡12h，抽滤，测定滤液中花色苷的总量，计算吸附量和吸附率。
Q?(C0?C1)V1 (式4-3) m32