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(2) pH示差法：该法依据之一是花色苷发色团的结构转换是pH值的函数，依据之二是起干扰作用的褐色降解物质的特性不随pH值而变化。通过实验确定两个对花色苷吸光度差别最大但是对花色苷稳定的pH值，根据公式可以计算出花色苷的总量[43]。杨兆艳[45]用pH示差法测定桑椹原汁中花色苷含量为0.02％。
(3) 差减法：就是先测定样品在可见光区的最大吸光度，经二氧化硫或亚硫酸盐漂白后，再测定一次吸光度，二者的差值就是花色苷的吸光度，参考用标准花色苷绘制的工作曲线，可将吸光度换算成浓度。此法的原理是基于花色苷可被二氧化硫或亚硫酸盐漂白，漂白后其在可见光的光谱特征消失，而干扰物质的吸光度却很少受二氧化硫或亚硫酸盐的影响。差减法因所使用的漂白剂也能降低某些干扰组分的吸光度而使总花色苷的实测浓度比理论浓度偏高，另外此法也不适合于C4位上有苯基或甲氧基的花色苷的定量分析[43]。
(4) 高效液相色谱法（HPLC0：HPLC不仅用于花色苷的定性，还可用于定量分析。其原理是基于花色苷的浓度与色谱图中的花色苷的峰面积成正比，因此可用于定量分析。目前，HPLC已被广泛的应用于水果、葡萄酒、果汁、花卉中总花色苷和单个花色苷的定量分析[43]。王贞强等[46]用HPLC法测定葡萄与葡萄酒中的花色素苷，在测得的9种花色苷中，均以锦葵色素-3-O-葡萄糖苷含量最高，分别占总成分的39.71％和69.55%。 1.2.3 花色苷的生理功能
(1) 抗氧化活性：细胞中的氧在转变成水之前，会产生许多活性氧（ROS）。正常情况下，生物体内活性氧的生成与清除处于动态平衡状态，当各种因素打破这一平衡而致活性氧浓度超过生理限度时，多余的氧自由基就会致使组织损伤，乃至诱发各种疾病和促使机体衰老。而各种抗氧化物质，可以将多余的活性氧自由基清除掉，从而保护细胞、组织免遭氧化伤害。Wang J等[47]采用了化学荧光发光法研究了紫甘薯花色苷对活性氧的清除作用，结果表明，紫色甘薯花色苷对·OH、H2O2等活性氧均有清除作用，尤其对·OH的清除能力强于抗坏血酸，且与浓度呈剂量关系。
(2) 抗癌活性：研究认为环境因素在癌症的发生和发展中发挥着重要的作用。因此完全可以通过外部环境的改变来降低肿瘤的发生率。正常细胞在接触各种致癌因素后，都会经过启动、促进和发展三个阶段才会转化为肿瘤细胞。在癌症形成的三个阶段中，都有高度活泼性的自由基参与。即致癌物必须在体内经活化而成的自由基攻击DNA才能致癌。因此各种抗氧化物在一定程度上都具有抑制肿瘤的功能。花色苷有比较强的抗氧化活性，因此也应该具备抗肿瘤活性，它
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第1章 绪论
可以通过抑制肿瘤细胞的增殖、转移和诱导癌细胞的凋亡实现抗癌的目的。常徽等[48]对黑米花色苷的抗肿瘤活性研究结果显示，黑米花色苷可以明显影响HL-60细胞周期进程，100μg/ml的黑米花色苷作用24小时，可使S期细胞比例明显降低，G0/G1细胞比例明显升高，同时G2/M细胞也有所升高，但不显著。可见黑米花色苷可引起HL-60细胞阻滞于G0/G1期，从而抑制其增殖。
(3) 抗炎活性：环氧化物酶（COX）是催化花生四烯酸生成前列腺素G2（PGG2）和前列腺素H2（PGH2）限速酶。COX-2在正常生理条件下是不表达的，在许多促炎症和致突变因素的影响下，通过MAPK途径、核因子（NF-??）和AP-1途径等诱导COX-2的表达，COX-2通过多种机制影响细胞的增生凋亡、血管的生成、局部的侵润和免疫功能的抑制，参与病理过程。在众多花色苷中，具有邻二羟苯基结构的花色苷（花翠素、花青素）通过抑制MAPK途径中COX－2的表达阻止炎症的发生[49]。天然药理学认为多吃樱桃能减轻关节炎和疼痛[50]。Wang等[51]研究了从酸樱桃中分离得到的花色苷和它的糖苷配基矢车菊色素的抗炎作用，结果表明：矢车菊色素的抗炎活性强于阿斯匹林。
(4) 抗动脉粥样硬化：动脉粥样硬化（Atherosclerosis，As）是一种严重威胁人类健康的疾病。流行病学研究显示，血管内皮细胞的损伤是动脉粥样硬化发生的起始环节，而氧化性低密度脂蛋白（Oxidized low-density lipoprotein，Ox-LDL）的形成是造成血管内皮损伤，促进动脉粥样硬化发生发展的关键因素之一。花色苷可以增加细胞内超氧化物歧化酶和谷胱甘肽转换酶的活性而减少LDL的氧化进而抑制动脉粥样硬化的发生。余小平等[52]研究了黑米皮花色苷对动脉硬化斑块稳定性影响。发现实验中老鼠的血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C与对照组相比含量分别下降了37.13％、26.60％、47.21％和36.52％，小鼠As斑块中薄纤维帽和大脂核的频数分别降低了57.38％和53.13％，不稳定斑块的面积也有所下降。说明黑米皮花色苷能促进小鼠晚期斑块的稳定性。
此外，花色苷还具有抗菌，降血糖，抗衰老，抗皱作用等方面的作用。
1.3 牡丹花色与花色苷的研究
牡丹（Paeonia suffruticosa Andrews）为我国著名花卉、花朵硕大、花容端丽、品种繁多，雍容华贵，被称为“万花一品”、“冠绝群芳”的“花王”。又名百两金、木芍药、富贵花、洛阳花等。唐代李正封有“国色朝酣酒，天香夜染衣“的诗句，又使“国色天香“成为牡丹的雅号。
牡丹原产于我国秦岭等地，为毛茛科、芍药属落叶性野生小灌木，在我国有一千五百余年的栽培历史[53]。中国现存牡丹8个种、2个变种、1个亚种、1个
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变型，洛阳已发现的就有2个种，即紫斑牡丹和杨山牡丹。经过人工栽培后，出现了黑色、黄色、绿色、紫色和复色等，还出现了许多过渡性的花色。而今，洛阳牡丹的花色甚丰，有红、白、粉、黄、紫、蓝、绿、黑及复色等9大色系，五彩缤纷，万紫千红[54]。自古洛阳人爱花成俗。邵雍的“洛阳人惯见奇葩，桃李开花未当花，须是牡丹花盛发，满城方始乐无涯”的名诗，正是这种习俗的真实写照[53]。
洛阳牡丹具有广泛的应用价值，一是应用于观赏，二是药用，还可食用[2]。 自建国以来，尤其是牡丹被确定为中国的国花之后。国内对于牡丹的研究越来越多，也更加的深入。目前对于牡丹的研究主要集中在种质资源调查、区域分布、国内外的传播历史等以及开发牡丹根皮的药用价值，牡丹的育种及花期调控等方面的研究也较多。而对于牡丹花色以及牡丹花瓣中所含生物活性物质研究则相对较少。例如国内外对牡丹黄酮和花色素方面的研究则鲜见报到。王亮生等[55]的研究证实牡丹花中含有6种花色苷，其中中国地区的牡丹不含有天竺葵色素-3-O-葡萄糖苷（Pg3G）。而根据已有的对其他植物花色素与花色苷的研究知道，它们具有重要的生理活性作用，包括抗氧化、抗菌、抗癌、抗炎等多种作用。牡丹中所含花色苷种类和含量的多少也与牡丹五彩缤纷的颜色有很大的关系。
洛阳是中国牡丹的重要产地之一，具有丰富的牡丹资源。在每年花期过后都有大量的牡丹花资源白白的浪费掉，假如能够充分的利用这些资源，则对经济的发展有更好的促进作用。
1.4 主要的研究内容、目的和意义
本文按国际照明委员会（CIE）表色系统测定洛阳地区不同品种牡丹花的颜色，按照量化的标准通过聚类分析的方法根据颜色的不同对牡丹花进行分类，达到与传统分类方法相互补充，完善；利用盐酸酸化甲醇对新鲜牡丹花瓣浸提，然后利用高效液相色谱法（HPLC）测定不同品种牡丹花花瓣提取液中花色苷化合物种类和含量，结合花色测定的结果，研究牡丹花色与花色苷含量和种类的关系，为丰富牡丹花色提供科学的理论依据；对提取的牡丹花瓣提取液用大孔吸附树脂法进一步纯化，获得树脂纯化牡丹花色苷的最优工艺；研究树脂纯化后的牡丹花色苷对自由基的清除作用以及还原力的大小，对蛋白质损伤的保护作用。为今后综合开发洛阳地区的牡丹资源打下理论的基础。
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第2章 牡丹花色测定及其表型分析
第2章 牡丹花色测定及其表型分析
2.1 引言
牡丹野生种花色单一，但经过漫长的自然选择以及人为因素的作用，花色逐渐丰富。隋朝时牡丹主要有红、白、黄色；唐朝时增加了紫色，同时白色中有浅白和白，红色有殷红和桃红；宋朝时增加了绿色和一花两色，红色和紫色都有了深浅之分，黄色出现了浅黄和深黄，白色中又有了洁白色；明朝时出现了过渡花色，如红色又分为大红、桃红、粉红等；清朝时出现了黑、蓝，同时过渡花色越来越丰富，花瓣上有白色条纹、放射状线纹、珠状斑点。现代，牡丹的花色在原有的基础上增加了雪青及复色等。目前已形成了红、粉、紫、白、黄、黑、绿、蓝、复色等色系。各色系又派生出不同的近似色、过渡色，如红色系有桃红、脂红、肉红、紫红等；白色系有洁白、牙白、粉白等；黄色系有淡黄、暖黄、米黄、金黄等；紫色系有深紫、红紫、粉紫、浅黄紫等；雪青色还有淡雪青色等
[55]
。
花色是牡丹的重要观赏形状之一，同时也是品种分类的重要指标之一。花色
的科学测量和定量分析是观赏植物花色研究中不可缺少的一部分。长期以来，牡丹花色的评价主要依靠人为观测和定性描述，具有很大的主观性和随意性。仪器测色法将花色数量化，有利于花色的精确测定，在园艺植物花色测量上使用十分广泛，曾被用于菊花、洋桔梗、月季、香石竹、兰花、蝶豆、矮牵牛、芍药等花卉的花色测定[56]。Wang[57]和Zhang等[58]采用色差仪分别测定了中原牡丹、西北牡丹的花色表型。本章利用分光色差仪按国际照明委员会（International Commission on Illumination，CIE） 表色系统对94个中原牡丹品种的花色进行测定，并在此基础上，通过CLUSTER过程，采用Ward离差平方和法将花色三刺激值L*、 a* 和b*进行了聚类分析。本研究为深入研究牡丹花色提供了前提条件，对于牡丹品种分类、新品种鉴定、花色遗传育种、牡丹种质资源保护等均具有重要意义。
2.2 实验材料与方法
2.2.1 实验材料
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牡丹花于2009年4月10日和4月18日采自洛阳市土桥花木种苗有限公司和国家牡丹园，共94个品种（品种名及编号见表2-1）。
2.2.2 牡丹花色的测定
花朵采集后取新鲜花瓣，用色差仪（NF333 spectrophotometer, Nippon denshokn，光源C/2°） 按国际照明委员会（International Commission on Illumination, CIE）表色系统测定花色。花色的CIE表色系统的明度L*值、色相a*值、色相b*值在三维色度坐标系上，L*轴垂直于a*轴、b*轴组成的平面。L*值从0到100的变化过程中，表示明度由黑变亮逐渐增加；红绿属性a*值由负值变化到正值，表示绿色减退红色增强；黄蓝属性b*值由小变大，表示蓝色的减退黄色的增强。彩度C*和色相角h分别根据公式C*=(a*2+b*2)1/2 和h=arctan(b*/a*)计算。C*值表示到L*轴的垂直距离，距离越大，彩度越大[59]。每个品种均取5个不同植株上的花瓣，每瓣测定3个位置，对准集光孔进行测量，然后取平均值。
2.2.3 数据分析
利用SAS软件（9.0版本），通过CLUSTER过程将CIE表色系统的L*、 a* 和b*采用Ward离差平方和法进行聚类分析[60]。利用Microsoft Excel 软件分析花色的三刺激值之间的关系。
2.3 结果与分析
2.3.1 中原牡丹品种花色的测定
经过多年的培育和驯化，牡丹具有越来越多的观赏性状，花色表现尤为突出。目前已形成了红、粉、紫、白、黄、黑、绿、蓝、复色等色系。各色系又派生出不同的近似色、过渡色，如红色系有桃红、脂红、肉红、紫红等 [55]。以洛阳牡丹为代表的中原牡丹品种群是我国最大的牡丹品种群，是中国牡丹的精华所在。本文采用分光色差仪对94个中原牡丹品种的花色进行测定分析，结果如表2-1所示：94个品种牡丹花色在CIE表色系统坐标系上分布广泛，红绿属性a*值的范围介于-10.04~49.38之间，黄蓝属性b*值介于-18.97~37.15之间，亮度L*值介于23.17~88.99之间。
2.3.2 中原牡丹品种花色的聚类分析
聚类分析（cluster analysis）是一组分类方法的总称，是对变量或观察个体
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