的DNA分子上(克隆载体)。这些重组合的DNA分子是由两个或数个不同来源的DNA片段共价连接而成，称为重组体分子(recombinant DNAs)。
d.重组DNA的转化——将重组DNA分子从试管中转移到能使其进行DNA复制的寄主细胞的方法。(A method for moving recombinant DNA from test tube into a host cell that can provide the enzymatic machinery for DNA replication)
e.转化子的筛选与鉴定——筛选或鉴定含有重组体DNA分子的寄主细胞的方法。(Method to select of identify those host cells that contain recombinant DNA) 4．DNA片段的产生与分离
我们知道所谓DNA文库(DNA library)是指，来自特定生物生命体基因组的全部DNA片段之每一条片段，都与克隆载本单独形成重组分子，此种包含有该特定生物生命体之全部DNA片段的重组克隆分子的集合体，称做DNA文库。简言之，是生物生命体的基因组DNA片段化之后形成的成千上万的DNA片段都被同一克隆载体所克隆。因此生物生命体的全部遗传信息通过基因文库(DNA文库)中的各种克隆得到了保存与体现，犹如书库保藏着人类的全部知识一样。由此可见，基因克隆与分离的头一步就必须对基因组DNA进行片段化。
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(1) 核酸内切限制酶的切割法
真核基因组DNA经核酸内切限制酶消化之后不进行凝胶电泳分部分离而直接与克隆载体重组，这种克隆方法，在早期研究中使用过，特称为“鸟枪法(shotgun approach)”。
缺点：①形成的重组体分子，实际上是一群带有不同大小的插
入片段的重组载体的混合群体。造成目的基因筛选困难、工作量大、费时、费力、费钱。
②有些目的基因的核苷序列中可能会存在一个甚至数个限制酶识别位点。因此，克隆的目的基因有可能被切成若干片段。
③产生的有些片段可能太大，有些片段又可能太小，因此有些基因无法被克隆，形成不完全的基因库。
(2) 机械切割法
构建DNA文库最好使用随机片段化的方法制备DNA的克隆片段。机械切割法和限制酶局部消化法处理基因组DNA，都可以产生出随机片段化的DNA克隆片段群体；
机械切割的标准状况是：1500转/分搅拌器中高速搅拌，30分钟便可将DNA分子切成平均长度8kb的分子群体。 (3) 限制酶局部消化
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用来产生DNA克隆片段的限制酶，必须考虑到它对DNA序列应该具有最佳的识别位点分布规律。例如选用?噬菌体载体构建基因文库，就不能够承载大小25Kb的EcoRI片段，在这种情况下最好选用识别序列为4bp的Sau3A、HaeⅢ以及AluI等限制酶。
(4) DNA片段的大小分部
*蔗糖密度梯度离心——除去不适于克隆的过大或过小的DNA片段；
*琼脂糖凝胶电泳——此法可以在很窄的范围内获得高纯度的某种DNA片段，或是大小同源的DNA片段。此法的缺点是，琼脂糖的污染有时会抑制尔后的酶催反应。
5．基因文库
(1)基因文库和DNA文库
*基因文库亦叫基因银行(Gene bank)，系指在一种载体分子中随机地克隆着某种生物、组织、器官或细胞类型的所有的DNA片段而构成的克隆集合体。在理想的情况下，它应包含有该生物种全部的遗传信息。在过去也称基因文库为鸟枪收集。 *DNA文库(DNA library)，基因文库是在基因工程诞生的早期就已被使用，已经习惯且通俗易懂。但近年来一般称基因文
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库为DNA文库，这是一种更加符合实际更加科学的名称。因为基因文库从本质上讲是由来自染色体基因组的全部DNA片段组成的。
(2) 基因组文库和cDNA文库
*基因组文库(Genomic library)，系指生物体基因组DNA经过核酸内切限制酶作部分消化切割之后，克隆在适当的载体分子上，然后将这重组的混合物转化给例如大肠杆菌这样的寄主菌株，于是便构成了包含该生物体整个基因组全部遗传信息的基因组文库。
*cDNA文库(cDNA library)，将纯化的某种生物的特定发育阶段或组织之mRNA，经反转录酶作用合成双链的DNA群体，同适当的载体分子重组之后转化给寄主菌株，如此便构成了特定的cDNA文库。这种文库与基因组文库不同，它只包括特定的发育阶段特定组织或器官中表达的基因，而不是全部的基因。
二、基因克隆与分离的实验策略 1．物理策略(physical strategy)
基因的克隆与分离从大的方面看，可以区分为物理策略和生物策略两大类。
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所谓物理策略是，首先构建基因组的物理图谱，如限制图和测序图，然后再据此确定基因的位置、全序列结构、表达蛋白质及其生物功能。
基因组DNA是一种线性结构，使用物理策略分离目的基因，是按照染色体、YAC克隆(或BAC克隆)、Cosmid克隆、亚克隆这种由大到小的过程，逐渐克隆、分离和测序，最后完成目的基因及其基因组的全测序。
2．生物策略(biological strategy)
从具有某种表型(生物功能)的个体或细胞的基因组中，分离出与表型相关的基因片段，再以此为分子探针，筛选出基因的全序列和表达序列。以这种方式克隆分离目的基因的策略，称为生物学策略。 3．克隆样品的选择 (1) 蛋白质大分子
最早的功能基因克隆，是从分离纯化与特异表型相关的蛋白质开始的，然后根据蛋白质的氨基酸顺序反推出相应的核苷酸顺序，并以此为依据合成分子探针，从基因库中筛选出目的基因。 *1.优点：
一般真核细胞中蛋白质种类的复杂度都比较低，仅有104种左右，故可比较容易地通过电泳分析得到间断的可分辨的图
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