构建起点RFLP标记克隆的限制图，并把其中最靠近目的基因的限制片段(B-H)亚克隆出来。
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将此B-H片段经放射性标记后用作分子杂交探针，从基因组文库中筛选与起点克隆具有重叠序列的新克隆——特称一步克隆。
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重复上述各步：
构建一步克隆的限制图
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亚克隆其中最靠近目的基因的H-E片段
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将此H-E片段用放射性标记后用作分子杂交探针筛选基因组文库
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从中得到与一步克隆具有重复序列的新克隆 特称二步克隆
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重复上述步骤，周而复始直至获得目的基因。
(2) 应用染色体步移法克隆目的基因的条件
从原理上讲，应用染色体步移法克隆目的基因是比较简单的过程，但它需要两个已知的条件：
第一， 需要知道起始克隆与目的基因的距离；
第二， 起始克隆在连锁图上的取向，否则就需按双向同时进行
染色体步移。
(3)影响因素
影响染色体步移顺利进行的主要有如下两个因素：
第一， DNA重复序列的存在——它会扰乱步移的顺序性，使
之“步入歧途”。例如在同一条染色体或另外染色体的其它位点拷贝重复序列。
第二， 无法克隆序列的存在——因为这样的序列插入到使用
的克隆载体上时，会发生致死效应。
5．大尺度物理图谱的构建 (1)问题的提出
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(a) 不同的材料其1cM的图距相当于不同的kb，例如：
人类1cM≈1000kb 拟南芥1cM≈290kb 番茄1cM≈750kb 小麦1cM≈3500kb
(b) 克隆的DNA片段也不是越大越好。这是因为大多数高等植物基因组DNA中，都存在着相当大量的散在的重复序列，所以克隆的DNA越长，出现重复序列的可能性也就越高，易使染色体步测出现困难；
(c) 克隆的DNA片段太短也不好，因为这样会影响探针标记强度，影响检测的灵敏性；
*现在有关农作物RFLP研究中，普遍选用400-2000kb的DNA片段构建随机的基因组文库。显而易见，常规的克隆技术是无法承接如此大分子量的DNA片段的。
(2) 解决问题的方法
对超大型DNA序列的作图及超长距离染色体步移所面临的困难，由于如下三个技术的出现，已得到较好解决。
(a) DNA分子大片段切割——应用切割位点稀少的核酸内切
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限制酶，例如：NotI、SfiI和PacI能够切割产生出超大分子量的DNA片段，即大片段DNA分子。此外，应用其它一些特殊核酸内切限制酶也可以切割形成大分子量的DNA分子；
(b) 大片段DNA分子的分离——应用脉冲电场凝胶电泳(PFGE)技术可以分离200-3000kb的大片段DNA分子； 长度超过50kb的DNA片段是难以用常规的琼脂糖凝胶电泳方法进行分离的。应用PFGE分离大片段DNA的基本操作步骤：
将研究材料样品的细胞包埋在低熔点琼脂糖中
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加入酶及有关试剂，从细胞蛋白质和RNA混合物中游离出DNA
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用具10个核苷酸识别序列的限制酶如NotI和Sfi1，切割游离的基因组DNA，可形成大小为50-900kb的DNA大片段
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凝胶块(含有大片段DNA)可直接埋在凝胶槽中作电泳分离，需经几天方可得到满意的分离效果。
(c) YAC库的构建——若用柯斯质粒作载体构建基因组文库，有两个问题有待解决：
其一，克隆能小，无法容纳分子量达数百kb的大片段DNA； 其二，需要相当大量的克隆群体才能完全覆盖整个真核生物
基因组DNA。
现已发展出一种新型的克隆载体，叫做酵母人工染色体(yeast artificial chromosome, YAC)。此种载体可以克隆数百kb的大片段DNA，并可如同染色体一样在酵母细胞中正常地复制。构建真核基因组YAC库的过程如图9-14所示：
YAC载体pY
反应I：选用EcoRI和BamHI对YAC载体pYAC4
作双酶消化
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结果：移走两端粒间序列，产生出具有EcoRI
粘性末端的两条臂分子，在子中都有
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