及转化两者的效率，那么要在一次实验中产生如此大量的重组体的可能性，无疑是微乎其微的。克服的办法是选用克隆能力大的载体建库：
a. 应用克隆能力为15kb(即插入片段平均分子量为15kb)的?载体，那么一个完全的基因文库所需的重组体数量便可下降到9×105；
b. 如选用克隆能力为40kb的柯斯载体，这个数字还可以进一步下降到3.5×105；
三、cDNA基因文库 1．cDNA基因克隆概述
真核生物基因组DNA十分庞大，以人的为例高达3×109bp，而且含有大量的重复序列。因此无论是用电泳分离技术，还是通过杂交的方法，都是难以直接分离到目的基因片段。这是以真核染色体基因组DNA为出发材料直接克隆目的基因的困难所在。 cDNA基因克隆可以部分解决上述的困难，这是因为它的复杂度仅及基因DNA的1%左右。cDNA基因克隆的基本过程是通过一系列的酶催反应，使总poly(A)mRNA→双链cDNA→与适当载体分子重组→转化给寄主菌株细胞。如此便构成了cDNA基因文库，此种技术已成为当今研究真核生物分子生物学及基因工程的基本手段之一。
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2．cDNA文库的构建
第一步：分离细胞的总RNA，并根据其3?-端具有poly(A)
尾巴的特征，应用oligo(dT)法，从中纯化出主要含mRNA的分部
第二步：合成第一链cDNA，即以mRNA分子为模板
加上适当的引物，引导反转录酶合成第一链cDNA。常用的有oligo(dT)引物法，和随机引物法。
第三步：将mRNA-DNA杂交分子转变为双链DNA分子，
其具体的办法有： a. 自我引导合成法，
系用碱处理使mRNA模板水解，并在第一链cDNA末端形成发夹结构作为第二链合成的引物； b.RNaseH降解法
该酶可识别mRNA-DNA杂交分子，并将其中的mRNA模板消化成许多短片段
第四步：将双链DNA同适当载体分子重组，并导入寄
主细胞增殖，于是便构成了cDNA文库。体外
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重组的方法有：
a. 用末端转移酶给双链cDNA分子作同聚物加尾；
b. 加adapter或linker；
3．低丰度mRNA的cDNA克隆 (1 )mRNA丰度
在许多组织和培养的细胞中，各种mRNA的含量都是极不相同的。有些类型mRNA含量十分丰富，每个细胞可拥有数千拷贝；有些类型mRNA则相当稀少，每个细胞仅有少数几个拷贝。
所谓mRNA丰度，系指一个细胞 中某种特定mRNA分子拷贝数的多寡，即通常所说的丰富程度。据此可将mRNA分成高丰度、中丰度和低丰度三种不同的类型。
表9-2 一种典型的真核细胞mRNA群体的丰度等级及其复杂性
丰度等级 相应丰度等级的在相应丰度等级中每个细胞所含的相mRNA群体占总所含的不同种类应丰度mRNA序mRNA的百分数 mRNA序列数目(个) 列的拷贝数(个) 22 30 3500 49 1090 230 29 10670 14 高丰度 中丰度 低丰度 (2) 高丰度mRNA的cDNA克隆
有些基因的mRNA含量相当丰富，例如：
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胰脏组织中的——胰岛素基因的mRNA； 血红蛋白细胞中——珠蛋白基因的mRNA； 鸡输卵管中——卵清蛋白基因的mRNA。
从这些组织或细胞中分离出来的总mRNA，不需进一步纯化，就可直接用来合成双链DNA，并构建基因文库，分离上述这些目的基因。因此说，分离高丰度的mRNA的目的基因之cDNA克隆，实际上并不存在什么困难。例如应用digo(dT)纤维素层析法，就可以从富含poly(A)mRNA制剂中纯化出珠蛋白mRNA。
(3)低丰度mRNA的cDNA克隆
对于低丰度的mRNA的cDNA克隆，通常是构建cDNA基因文库。组成一个合理的、完全的cDNA基因文库所必须的重组体克隆的数目，可以根据Clarke-Carbon公式计算。在典型的情况下，对大多数的低丰度mRNA，建立105个克隆就已足够了。
大体上讲来，在一定的发育阶段，哺乳动物的细胞含有10000到30000种不同的mRNA序列。例如人成纤维细胞大约有12000种不同的mRNA序列。
从表9-2可以看到，低丰度的mRNA每个细胞仅有14个拷贝
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左右，其总量约占总mRNA的30%，其中约有11000个左右不同种类的mRNA。因此，为获得一个能够代表全部低丰度mRNA的序列的cDNA基因文库，所必须的最低克隆数(理论值)应是11000/0.30=～37000。
但考虑到在①实验取样的差异；②以及有些序列容易克隆，有些序列不易克隆等因素，因此就必须增加克隆数目。以人成纤维细胞为例，为使其中某些特异的低丰度mRNA之cDNA克隆达到99%的期望率，按Clarke-Carbon公式计算需要170000个克隆。
这个数字是目前实验技术所能达到的。因为无论是用同聚物加尾法，还是双衔接物法，每微克的双链cDNA都可以产生出1×105～6×105个的菌落。 4．稀少mRNA的cDNA克隆
一些含量极低的稀少mRNA的cDNA克隆，是无法应用菌落原位杂交技术检测的。根据一些作者的计算，使用体外标记的mRNA或cDNA作探针，可以检测出仅占总mRNA 0.05%～0.1%低丰度的mRNA的cDNA克隆。然而在实际操作中，要检测出含量不到总mRNA 0.5%的低丰度mRNA之cDNA克隆，仍有极大的困难。 下面介绍一些解决稀少mRNA的cDNA克隆的方法。 (1)分部分离法
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