第三, 现假阳性的几率比较低。
由于每一个cDNA克隆都含有一种mRNA序列，因此阳性杂交信号一般都可认为是有意义的，其阳性克隆将会含有目的基因序列。
第四, 具有特殊的用途。
①克隆在原核生物如E.coli中表达的真核基因，应用cDNA克隆技术分离；
②另一个特殊用途是基因的核苷酸序列结构测定； ③cDNA克隆的第三个特殊用途是，关于在发育过程中时间调节基因(temporally regulated genes)的表达特征的分析；
④组织特异基因的表达特性的分析，亦要用cDNA克隆。
四、基因组DNA克隆 1．cDNA克隆的局限性
*1. cDNA克隆只能反映着mRNA的分子结构，而没有包括基因组DNA的间隔序列；
*2. cDNA基因文库中，克隆的分布状态反映着mRNA的分布状态，相应于低丰度mRNA的cDNA克隆难以分离；
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*3. 不能够克隆基因组DNA中非转录区段的序列，因此无法满足研究基因编码区外侧的调控序列的结构与功能的要求； *4. cDNA基因文库所函盖的基因类型与数量直接受不同的组织和不同发育阶段的制约，也就是说由不同组织或不同发育阶段构建的cDNA文库是互不相同的。 2．基因组DNA克隆的优越性 *1. 基因种类的全面性
在一个完全的基因组文库中，生物生命体的每一个基因都会有一个克隆。 *2. 基因结构的完整性
所克隆的基因可包括外显子、内含子、启动区以及终止区等全部的基因结构部分； *3. 克隆基因的恒定性
所函盖的克隆基因的数量及种类不受组织及发育阶段的影响。 *4. 基因的功能性
适用于研究基因的表达与调控。 3．构建基因组文库的载体类型
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(1) 应用?噬菌体载体构建基因组文库 *1. 过程(步骤)：
制备出发材料之基因组DNA
↓
限制酶消化产生适于克隆的DNA片段
↓
克隆片段与?噬菌体载体重组
↓
转化到大肠杆菌寄主细胞
↓
含有目的基因克隆的筛选
*2. 库容大小计算：
以人基因组为例，其分子量大小为3×109bp，经EcoRI酶切消化产生的DNA限制片段平均大小为4kb左右。因此至少得筛选7×105以上的独立的重组体，才有可能分离到一个含有目的基因序列的克隆。
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但实际构建的基因组文库之库容大小应比这大3～10倍，所以实际库容应达106以上才有效(见Clarte-Carbon公式)。
*3. 可能产生的问题：
平均酶切DNA片段为4kb之EcoRI限制片段，如此基因组DNA中的目的基因序列有可能被EcoRI切割一次甚至多次；这样就不可能以单一片段形式获得一个完整的基因序列。
目的基因有可能被包容在克隆载体无法承载的大分子量的DNA片段之中。也就是说如此构建的是不完全的基因组文库，目的基因可能被遗漏掉。
*4.解决办法：
通过基因组DNA随机片段化，使之形成大小～20kb的克隆片段，这些问题便可得到较为满意的解决：
a. 通过机械切割法，使基因组DNA发生随机断裂；
b. 采用两种限制酶混合消化基因组DNA； 把酶切作用控制在局部消化的程度，可得到平均大小为10～30kb的DNA片段，然后再
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经过蔗糖梯度离心或制备凝胶电泳，从中分离出20kb左右的DNA片段群体。 c. HaeⅢ-AluI双酶消化法
这是两种识别序列毫不相干的、形成平末端的核酸内切限制酶。经其对真核基因组DNA作局部酶切消化后，电泳分部收集20kb左右的随机的DNA片段群体。
但由于这两种酶切割的结果是形成平末端，因此需加上适当的接头，例如EcoRI接头等等。为了防止克隆DNA片段中可能存在的EcoRI位点被切割，需对DNA作甲基化处理。 HaeⅢ识别序列：
5??GG↓CC?3?
AluI识别序列：
5??AG↓CT?3?
(2) 应用柯斯质粒载体构建基因组文库
?噬菌体载体克隆能力有限，真正有效的范围仅为15kb左右，而柯斯质粒载体可克隆长约45kb的外源DNA片段(Gene)，而且还可以在体外被有效地包装。因此柯斯质粒载体十分适合于
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