构建真核基因组文库。 *1.建库过程：
应用Sau3A酶局部消化真核基因组DNA
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收集MW=35～45kb的DNA片段群体
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同业已用Sau3A同尾酶(如BglII)作了线性化处理的柯斯质粒载体DNA连接
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体外包装后感染大肠杆菌寄主细胞，进行复制扩增，形成基因组文库。
*2.缺点：
a. 用菌落杂交法筛选柯斯质粒载体之基因组文库，其敏感性要远远低于?噬菌体载体基因文库的噬菌斑杂交法。
(噬菌斑杂交的敏感性高于菌落杂交)；
B .柯斯质粒载体的基因组文库不像?噬菌体载体基因文库易于保藏。?噬菌体之基因文库几乎可无限期保藏，而柯
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斯质粒载体则不行；
c. 一般说来，由噬菌斑杂交产生的本底，总要比由菌落杂交形成的本底低得多。
五、基因定位克隆 1．基因定位克隆概述
基因定位克隆(map-based cloning)，是用于分离其编码产物尚不知道的目的基因的一种有效的方法。从理论上讲，任何一种可鉴定出有一个突变的基因，都可以通过基因定位克隆予以分离。 (1) 基因定位克隆程序：
将目的基因(即目的基因的突变)定位到染色体上
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在目的基因的两侧确定一对紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记
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利用最紧密连锁的一对两侧分子标记作探针，通过染色体步移技术，将位于这两个分子标记之间的含目的基因的特定基因组片段克隆并分离出来；
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根据其同突变体发生遗传互补的能力，从此克隆中鉴定出目的基因。
(2) 成功应用基因定位克隆分离目的基因的必要条件：
a. 以酵母人工染色体YAC(yeast artificial chromosome)为载体构建含有大片段DNA的YAC库；
b. 要有可用的同目的基因紧密连锁的DNA探针，理想的情况是两者之间的遗传图距在数百kb之间。
2．RFLP分子标记
用于染色体步移(chromosome walking)的分子标记通常是RFLP。所谓RFLP(Restriction fragment length polymorphism)，即DNA限制片段长度多态性，它是指应用特定的核酸内切限制酶切割有关的DNA分子，所产生出来的DNA片段在长度上的简单变化。
从不同生态型(ecotype)或不同的地理隔离群(geographical isolate)植株分离的总DNA中，同源的DNA分子之间通常会表现出序列的趋异性(divergence)，形成RFLP。也就是说它们中间已经发生了碱基对的取代、缺失、插入或重排等变化，其中有些变化导致了限制酶切割位点的更动。
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在这类变化当中，有不少都是属于“沉默突变”(silent mutations)，但由于它们是发生在基因间隔区、内含子以及外显子序列中的密码子3?-碱基处(即“简拼”或“摇摆”部位)，所以不会影响到表型特征的变化。然而这些“沉默突变”偶尔也会移走或增加某些限制酶的切割位点，从而产生出RFLP。 毫无疑问来自同一物种的不同地理隔离群、不同的生态型或是不同的近交系的DNA，往往也具有RFLP。通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，经EB染色后置UV下观察，这些RFLP更转变为肉眼可见的电泳谱带模式。因为这些RFLP是由于DNA分子中特定变化(突变)引起的，因此它们也能够像其它遗传标记一样进行定位，成为一种十分有用的分子标记。 3．RFLP的作图原理与步骤
在实际的RFLP作图中，通常总要涉及许多种不同的生态型，并使用众多的核酸内切限制酶及大量的杂交探针，而且还需要通过计算机进行结果分析。因此是一项相当艰巨而烦琐的工作。 (1)简单例子：
a.两个不同的拟南芥生态型：Columbia生态型
Niederzenz生态型
b.两个杂交探针：基因A
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基因B
c.一种限制酶：EcoRI
(2) 作图步骤：
从这两个不同生态型的拟南芥菜提取的两份总DNA
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各自经EcoRI酶切后，分别作琼脂糖凝胶电泳和Southern转移
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分别同放射性标记探针A和B杂交
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两种生态形DNA同两种探针杂交结果均呈现多态性现象。这说明：在这两个生态型的不同大小DNA限制片段上，都存在着A基因和B基因序列。
4．染色体步移
(1)染色体步移实验过程
在染色体步移的起点克隆中，具有一个与待分离的目的基因尽可能靠近的已鉴定的分子标记(在本例中是RFLP)
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