应用按分子量大小分部分离技术富集克隆的mRNA，其常用的方法有：
a. 蔗糖梯度离心法； b. 变性凝胶电泳法。
(2) 寡聚脱氧核苷酸纯化法
用化学合成的寡聚脱氧核苷酸纯化特定的mRNA。在已知某种待分离mRNA转译的蛋白质的局部或全部氨基酸序列的情况下，就可以据之合成该mRNA之寡核苷酸互补链。这些人工化学合成的寡核苷酸序列，如果长度足够(14～40个核苷酸)经体外标记之后，便可直接作为探针，从cDNA文库中筛选出含有目的基因序列的克隆。 (3) 差别杂交筛选法
应用差别杂交法筛选特异mRNA之cDNA克隆，亦是有效分离特异mRNA的cDNA克隆的方法之一。
如果在两种mRNA制剂中，有多种mRNA序列是两者共有的，但也有少数我们感兴趣的mRNA序列仅为其中某一种mRNA制剂所特有。在这种情况下，便可以使用“差别杂交”技术，从热休克或是用药物、激素处理前后的细胞中分别提取mRNA制剂中，鉴定出特异的mRNA之cDNA克隆。
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5．全长cDNA的合成
为了克服自我引导法合成双链cDNA的缺点，目前已发展出若干种不使用S1核酸酶(切割发夹结构)的全长双链cDNA的合成技术。
(1) oligo(dG)引导合成法
此法的核心技术是，在第一链cDNA尚未与mRNA模板分离之前，先在其3?-末端加上一段oligo(dC)序列，然后通过碱性蔗糖梯度离心处理，使mRNA模板分子发生水解，回收全长cDNA。继之以互补的oligo(dG)序列作引物引导第二链cDNA合成，形成全长的双链cDNA。具体过程如下：
以mRNA为模板合成第一链cDNA
↓
在mRNA模板未解离前，在其3?端加上一段oligo(dC)序列
↓
碱性蔗糖梯度水解(alkaline sucrose gradient)mRNA模板
↓
回收全长第一链cDNA(其3?-端具有一段poly(dC)
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↓
以互补的olig(dG)序列作引物合成第二链cDNA
↓
同聚物加尾或加衔接物，并与载体连接
(2) 载体引导合成法
载体引导的cDNA合成(vector-primed cDNA synthesis)具体步骤如下：
利用适当的核酸内切限制酶，使载体分子线性化；
↓
在线性化的载体分子的3?-端加上一段oligo(dT)尾巴；
↓
通过mRNA之poly(A)与线性化质粒oligo(dT)间的互补作用，mRNA便可退火连接到线性质粒载体分子上；
↓
以oligo(dT)为引物合成第一链cDNA分子，形成cDNA-质粒DNA重组体分子
↓
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在其cDNA末端加上一段oligo(dG)尾巴，再作碱性蔗糖梯度离心，水解mRNA模板
↓
由于在碱性环境条件下，质粒DNA双链解离，因此原先与质粒DNA连接的两条cDNA-1和cDNA-2也就彼此分开
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加入超量变性的oligo(dC)加尾的质粒DNA分子，与具oligo(dG)尾巴的cDNA分子连接形成双链质粒DNA-cDNA重组体分子
↓
具游离3?-OH羟基的oligo(dC)尾巴作引物，合成第二链cDNA，产生出双链的重组的质粒分子
↓
转化大肠杆菌细胞，获得具不同插入取向的cDNA克隆 (3) 置换合成法
这是一种十分有效的全长cDNA合成法，它分三步进行：
第一步：质粒引物的制备——即具有一段oligo(dT)尾巴的
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质粒载体分子；
第二步：具有oligo(dG)尾巴的接头DNA的制备； 第三步：构建质粒-cDNA重组体分子。
质粒引物通过其oligo(dT)与mRNA分子上的poly(A)配对，mRNA分子便可连接到质粒分子上，作为模板合成第一链cDNA；此后在此cDNA链的自由端加上一段oligo(dC)尾巴，以便与具有oligo(dG)的接头分子退火连接；转化到大肠杆菌寄主细胞，经DNA连接酶的封闭作用，形成质粒DNA-cDNA重组体分子。 6．cDNA克隆的优越性
第一， 特别适用于RNA病毒的基因克隆
cDNA克隆以mRNA为出发材料，因此对于其增殖不经过DNA中间体的RNA病毒特别适用。例如流感病毒、呼肠孤病毒等。
第二, cDNA基因文库筛选比较简单，工作量小。
典型的真核生物在特定的发育阶段仅具有10000～30000个不同种的mRNA分子；而标准的真核基因组DNA则可以形成100,000个到1,000,000个适于克隆的DNA片段；两者相差10～100倍！
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