谱。因此，对于一些大量表达的功能蛋白质之编码基因的分离，还是比较容易的。 *2.缺点：
在任何类型的细胞中，都仅有少数基因表达成相应的蛋白质，而且其表达活性和种类还随着发育阶段的不同及环境因素的变化而变化，所以在不同的发育阶段和不同的环境条件下，不同类型的细胞中蛋白质的种类都是不完全的，也不尽然相同。
况且还有许多基因的蛋白质产物是未知的，或者其纯化量不足以进行氨基酸序列分析及相应抗体的制备。因而要从蛋白质水平来分离目的基因，显然也是有困难的。 (2) mRNA大分子
*高等真核生物一般具有105种左右不同的基因，但在一定的发育阶段的单个细胞或个体中，都仅有15%左右的基因得以表达，产生出大约15000种不同的mRNA。可见mRNA的复杂度与蛋白质的复杂度比较接近。
*正是由于这种基因的差别表达，才决定了高等植物的发育分化、细胞周期、对环境压力的反应，以及衰老与死亡等所有的生命过程。
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*植物的正常代谢过程或者病理变化，以及光温的育性效应，不管其是由单基因控制的，还是由多基因控制的，本质上都是由于基因表达的改变造成的。因此，比较不同的细胞或不同基因型的基因表达的差别，为我们了解植物的发育分化的分子本质，以及克隆分离与此相关的基因打开了方便之门。 *从mRNA出发克隆分离目的基因的技术程序：
a. 差别杂交技术(differential hybridization) b. 扣除文库技术(subtracted library)
c. mRNA差别显示(mRNA differential display) d. 代表性差别分析法(representational difference
analysis，简称RDA；中文又译作cDNA差式分析法)
(3) DNA大分子
真核生物基因组DNA的复杂度是蛋白质和mRNA的100倍左右，而且含有大量的重复序列。因此无论是采用电泳分离技术还是通过杂交方法，都是难以直接分离到目的基因(或其片段)的。
但基因组DNA具有完整性(包括protein和mRNA分子所不具有的非编码区序列)、恒定性(在单克隆细胞群体中，基因组DNA序列的种类和数量都是恒定的)、可直接进行克隆、序列分析及杂交识别，因此是分离基因的主要样品(出发材料)。
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以DNA为出发材料分离目的基因的优点：
a. 可以分离到完整的基因结构序列，包括外显子和内含子以及启动区序列等；
b. 数量恒定，不会受到生物体发育状态、发育阶段以及不同器官组织的影响；
c. 不必经过反转录或是氨基酸测序合成引物等程序，便可直接进行基因克隆；
d. 可直接进行核苷酸序列分析； e. 可直接进行核酸杂交鉴定；
4．基因文库库容测算
(1) 理论克隆数与实际克隆数
由某种生物材料构建的完全的基因组DNA之基因文库，所应具有的理论克隆数和实际克隆数是有相当差别的。 *1. 理论克隆数：
是用给体生物(例如细胞、真菌及动物或植物)的基因组DNA总量(分子量大小)，除去克隆片段的平均大小所得的数值。 理论克隆数受两个因素的影响，其一是给体生物基因组分子量的大小；其二是克隆片段的平均分子量，亦即是所用的克
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隆载体可能承接的外源片段的克隆能力。 *2. 实际克隆数：
由于DNA片段是随机克隆的，因此理论克隆数只是基因组文库所需的最小数值。从统计学上讲，这意味着从一个只含有最低重组体DNA克隆数的基因库中，筛选一种特定的单拷贝基因只有50%的几率。
而当被筛选的基因库是含有两倍的最低重组体DNA克隆时，那么获得某一特定基因的几率则可达75%。因此，为了达到以一种合理的几率筛选出单拷贝目的基因，一个完全的基因文库就必须含有3-10倍于最低重组体DNA克隆数。这个实际克隆数是由Clarke-Carbon公式计算。
表9-1 不同生物的完全基因组DNA之基因文库应具有的
理论克隆数和实际克隆数
克隆片段之平 均分子量大小 (bp) 5×103 10×103 20×103 40×103 2×106(细菌) 理论 实际 克隆数 克隆数 400 1831 200 100 50 919 458 278 基因组大小(bp) 2×107(细菌) 理论 实际 克隆数 克隆数 4000 18418 2000 1000 500 9208 4603 2300 3×109(细菌) 理论 实际 克隆数 克隆数 600000 2763110 300000 150000 75000 1381550 690774 345386
(2) Clarke-Carbon公式：
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这是在1975年由L. Clarke和J. Carbon提出的一种计算一个完全基因文库所需要的实际克隆数的公式。上表所例的实际克隆数就是按照这个公式计算的。
N= ln(1-p) ln(1-f) N=一个完全基因文库所应包含的重组DNA的转化子克隆数(实际克隆数)；
P=重组体群体中出现目的基因序列的几率(一般期望为99%)；
f=为限制片段的平均大小与基因组总量之比值；
以人?-珠蛋白基因(分子量约为1.5Kb)为例，其N值应是：
N=
ln(1-0.99) ln[1-(1.5×103/3×109)]
*这个数字表明，如果使用的载体不具有选择记号，那么就需要分离并鉴定9×106个独立的菌落或克隆。
*换句话说，我们必需拥有非常大量的重组体的DNA群体，才有可能汇集整个人基因组的全部DNA序列。
要分离鉴定如此大量的克隆(9百万个克隆)，再考虑到连接作用
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=9.2×106