生物化学实验报告
生物化学
实验报告
班级：食品08-1班 姓名：刘鸣畅
学号：080424102 指导老师：林善枝
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生物化学实验报告
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实验一 过氧化物酶活性的测定
1实验目的：
掌握酶活性的测定方法和原理。
2实验原理：
过氧化物酶是一种含铁卟琳的氧化酶，是利用H2O2将代谢中一些化合物氧化，其活性与呼吸作用和其一些生理过程有关。测定过氧化物酶的活性变化是植物生理和病理上一个常用的指标。
过氧化物酶能催化过氧化氢对某些物质的氧化，如催化过氧化氢氧化愈伤木酚作为被氧化的基质，呈现的棕色可在OD470检测。
3材料设备及试剂
3.1材料：
本实验中采用马铃薯皮。
3.2设备：
容量瓶（25ml）、量筒（25ml）、移液管（1ml）、研体、试管架 72型分光光度计、冰箱、离心机、1/100扭力天平、秒表。
3.3试剂：
0.2M磷酸缓冲液（pH=6.0)、反应混合液【0.2M磷酸缓冲液（pH=6.0)100ml，加入愈伤木酚0.019ml，开始实验前在加入30% H2O2 0.02ml，摇匀】
4实验步骤
称取一定量马铃薯外皮，加少许石英砂及0.2M pH6.0磷酸缓冲液磨成匀浆（分批加入并记录体积），至液体粘稠度适中，加入20mL缓冲液浸提15min后装入离心管。
在4℃静臵50min后用12,000rpm/min离心30min，取上清液放入冰箱待用。 在光径为1cm的比色杯中加反应液3mL，迅速加入10μL酶液，立即用擦镜纸盖住杯口，反复摇动比色杯，使反应体系迅速混匀。且在一加入酶液就开始计时，以10μL酶液加3mL不含H2O2的反应混合液作为空白对照，选用470nm波长，每30s记录光密度值。
以时间为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制酶促反应进程曲线，并根据反应初速度计算酶的相对活性。
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5实验数据及处理
马铃薯皮0.53g 缓冲液600微升
表１－１
t（min） OD t（min） OD
OD0.80.70.60.50.40.30.20.1001 0.5 0.185 7 3.5 0.502 2 1 0.238 8 4 0.554 3 1.5 0.276 9 4.5 0.603 4 2 0.334 10 5 0.669 5 2.5 0.396 11 5.5 0.732 6 3 0.45 酶促反应进程曲线0.1850.2380.2760.3340.3960.450.5020.5540.6030.6690.732123图１－１
45时间6
选用OD值在0.2—0.8之间的数值进行分析 V平均=[(0.502+0.554+0.603+0.669+0.732)- ( 0.238+0.276+0.334+=0.396+0.450)]/5=0.2732 规定UL=0.001OD/s，则U=273.2UL 马铃薯鲜重为0.53g
所以提取的过氧化物酶的相对活性为972.6UL/gFW
６实验过程及结果分析及感想
由酶促反应进程曲线可看出，加入酶液后OD值随着反应时间延长而增长，一段时间后达到最高值，之后随着酶活性下降而逐渐下降。
由此可得初步结论，即酶促反应速度随反应时间延长而逐渐变快，到一定程度（酶液与反应液浓度相当时），速度减缓，直至饱和。
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由于酶液用量没有拿捏得当，就用了10μl的量，以至于OD值未能完全处于0.2-0.8之间，对分析结果产生了一定影响。而且加酶液后没有混匀，也对测定结果产生影响，造成前几分钟OD值基本没变化。今后做实验我会注意操作，注重细节，在实验书的基础上摸索。
7思考题
1.比较过氧化物酶和过氧化氢酶在催化反应中的主要区别？
答：过氧化氢酶是专一的分解过氧化氢的酶，常作为植物代谢的一种指标；过氧化物酶能催化过氧化氢对某些物质的氧化，常作为植物生理与病理上的指标。
2.为什么在酶促反应实验中强调要混匀？为何不用煮死的酶液，而是在反应混合液中不加H2O2作空白对照？
答：混匀能使反应液与酶液充分混合，能更好观察酶促反应且不受干扰。若用煮死的酶液会造成与酶液OD之不同，而H2O2无色透明，不加则不会使反应液与酶液反应。
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