生物化学实验报告
表4-4
管号 1 2 测活缓冲液mL 1.50 1.25 底物溶液mL 1.25 1.25 酶液mL 0 0.08 在室温，以1号管为对照，每隔30s测2号650nm处的光吸收值 时间s 0 30 60 90 120 150 180 OD650
【Km测定】
取6个试管编号，按下表加样：
表4-5
管号 1 2 3 4 5 6 测活缓冲液mL 1.8 2.4 2.7 2.85 2.92 2.96 底物溶液mL 1.2 0.6 0.3 1.2 0.08 0.36 酶mL 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 对照管以测活缓冲液代替酶液，测3分钟时样品管650nm处的光吸收值的下降值 OD650
以1/[S]对1/v作图。
【脲的抑制作用】
取6个试管编号，按下表加样：
表4-6
管号 1 2 3 4 5 6 测活缓冲液mL 0 0.6 0.9 1.05 1.11 1.16 底物溶液mL 1.2 0.6 0.3 0.15 0.08 0.04 10mol/L脲mL 1.8 酶mL 0.08 对照管以测活缓冲液代替酶液，测3分钟时样品管650nm处的光吸收值的下降值 OD650 26
生物化学实验报告
以1/[S]对1/v作图，与底物影响之双倒数图对照比较，推出抑制类型。
【酶最适pH】
取8支试管，按记录表中要求加样
表4-7
管号 pH 缓冲液（ml） 酶液（ml） 底物溶液（ml） OD650 1 4.0 2 5.0 3 6.0 4 7.0 2 0.08 0.05 5 8.0 6 9.0 7 10.0
在室温先将缓冲液和酶液保温10min，再加入底物溶液，测定3min时样品管650nm处的光吸收值的下降值，对照管以测活缓冲液代替酶液。
【酶最适温度】
在室温到90℃之间选择不同温度测定酶活力，以找出酶在此条件下的最适温度。
取8支试管，按下表加样：
表4-8
管号 温度（℃） 测活缓冲液（ml） 酶液（ml） 底物溶液（ml） OD650
1 室温 2 30 3 40 4 50 2.5 5 60 6 70 7 80 8 90 20uL 2.5 先将缓冲液和酶液在相应的温度下保温10分钟后，再加入底物溶液，继续
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在相应温度下保温，测定3分钟时样品管的650nm处的光吸收下降值，对照液以测活缓冲液代替酶液。
【分子量及纯度】
做胶板
将玻璃板洗净去污，干燥，插槽（内高外低），双手均匀用力，压实，注分离胶至红线，加水层，等到凝固后倒出水层，吸干，注入浓缩胶，插梳子待凝胶后拔梳子，去掉密封条，板子方向掉个（内低外高）。
制胶液
SDS—不连续体系凝胶配制
表4-9
试剂名称 分离胶贮液 分离胶缓冲液 浓缩胶缓冲液 10%SDS 1%TEMED 蒸馏水 10%AP 点样
浓缩胶 1.5ml - 3ml 0.1ml 18μl 5.3ml 0.1ml 分离胶 8.5ml 2.5ml - 0.2 15μl 8.6ml 0.13ml 用微量注射器加样品和Marker各20μl至样品槽（Marker与样品间隔一个样品槽）。
电泳：
在两块板内外层分别加电极缓冲液（内至矮板，外过底线）盖通电（15mA/槽），待溴酚蓝跑到分离胶时，加大电流值（25 mA/槽），至溴酚蓝跑到底边。
染色
取出板胶，加水浸洗，开启胶板，除浓缩胶至界面，加染色剂考马斯亮蓝R-250，臵恒温箱2-4h。
脱色
回收染液，自来水清洗，脱色液脱色（３０h左右），清晰区带。
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５实验数据及其处理
5.1【分子量及纯度】
未知蛋白浓度测定 阳离子交换树脂出峰图
图4-4
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分子筛层析出峰图：
图4-5
表4-10
样品Ⅰ 样品Ⅱ 0.399 样品Ⅲ 0.085 样品Ⅳ 0.868 样品Ⅴ 0.445
（稀释10倍） （稀释10倍） OD值 0．404 所得数量关系： y = 0.8737x + 0.1064
样品Ⅰ 2.41 样品Ⅱ 0.313 样品Ⅲ 0.563 样品Ⅳ 0.717 样品Ⅴ 0.902
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