生物化学实验报告
实验二：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定种
子蛋白分子量
1实验目的：
学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。 掌握SDS-PAGE测定蛋白质分子量的操作方法
2实验原理：
SDS-PAGE是在要走电泳的样品中加入含有SDS和β-巯基乙醇的样品处理液，SDS即十二烷基磺酸钠，是一种阴离子表面活性剂即去污剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构，强还原剂β-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。电泳样品加入样品处理液之后，要在沸水中煮3-5min，使SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变形和解聚，并形成棒状结构。SDS与蛋白质结合后使蛋白质-SDS复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸残基结合一个SD分子，这是各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖。这样就消除了各种蛋白质本身电荷上的差异。样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于控制电泳过程。另外样品处理液中也可加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以沉入样品槽底部。
制备凝胶时首先要根据带分离样品的情况选择适当的分离胶浓度，例如通常食用的15%的聚丙烯酰胺凝胶的分离范围是10４－10５，即分子量小于10４的蛋白质可以不受孔径的阻碍而通过凝胶，而分子量大于10５的蛋白质则难以通过凝胶孔径，这两种情况的蛋白质都不能得到分离。所以如果要分离较大的蛋白质，需要食用低浓度如10%或7.5%的凝胶（孔径较大）；而对于分离较小的蛋白质，使用较高浓度凝胶可以得到更好的分离效果。分离胶聚合后，通常在上面加上一层浓缩胶（约1cm），并在浓缩胶插入样品梳，形成上样凹槽。浓缩胶是低浓度的聚丙烯酰胺凝胶，由于浓缩胶具有较大的孔径（丙烯酰胺浓度通常还为3－5%），各种蛋白质都可以不受凝胶孔径阻碍而自由通过。浓缩胶通常还PH较低（通常还PH=6.8)，用于样品进入分离胶前将样品浓缩成很窄的区带。浓缩胶聚合后取出样品梳，上样后即可通电开始电泳。
样品在电泳过程中首先通过浓缩胶，在进入分离胶前由于等速电泳现象而被浓缩。这是由于在电泳缓冲液中主要存在三种阴离子，Cl?、甘氨酸阴离子以及蛋白质—SDS复合物，在浓缩胶的PH值下，甘氨酸只有少量的电离，所以其电泳迁移率最小，而Cl?的电泳迁移率最大。在电池的作用下，Cl?最初的迁移
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速度最快，这样在Cl?后面形成低离子浓度区域，即低电导区，而低电导区会产生较高的电场强度，因此Cl?后面的离子在较高的电场强度作用下会加速移动。达到稳定状态后，Cl?和甘氨酸之间形成稳定移动的界面。而蛋白质—SDS复合物由于相对量较少，聚集在甘氨酸和Cl?的界面附近而被浓缩成很窄的区带（可被浓缩三百倍），所以在浓缩胶中Cl?是快离子（前导离子），甘氨酸是慢离子（尾随离子）。
当甘氨酸到达分离胶后，由于分离胶的PH值（通常PH=8.8）较大，甘氨酸离解度加大，电泳迁移速度变大超过蛋白质—SDS复合物，甘氨酸和Cl?的界面很快超过蛋白质—SDS复合物。这时候蛋白质—SDS复合物在分离胶中以本身的电泳迁移速度进行电泳，向正极移动。由于蛋白质—SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶。进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易地通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到交大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。
溴酚蓝指示剂是一个较小的分子，可以自由通过凝胶孔径，所以它显示着电泳的前沿位臵。当指示剂到达凝胶底部时，停止电泳，从平板中取出凝胶。在适当的染色液中染色几个小时，而后过夜脱色。脱色液去除凝胶中未与蛋白结合的背底染料，这时就可以清晰地观察到凝胶中被染色的蛋白质区带。通常凝胶制备需要1-1.5小时，电泳在25-30mA下通常需要3小时，染色2-3小时，过夜脱色。
SDS—PAGE还可以用于未知蛋白质分子量的测定。在同一凝胶上对一系列已知分子量的标准蛋白及未知蛋白进行电泳，测定各标准蛋白的电泳距离，并对各自分子量的对数作图，即得到标准曲线。测定未知蛋白质的电泳距离，通过标准曲线就可以求出未知蛋白质的分子量。
SDS—PAGE还常用于提纯过程中纯度的检测。纯化的蛋白质通常还在SDS点用上应只有一条，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDS—PAGE具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。
3材料设备及试剂
3.1.材料：
新鲜绿豆
3.2.试剂：
丙烯酰胺（Acr）凝胶贮液【22.2 克Acr，0.6克甲叉双丙烯酰胺（Bis），加水溶解并定容到100ml，过滤后使用】；
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10%SDS溶液； 10%过硫酸铵溶液； TEMED溶液；
分离胶缓冲液，1.5MpH8.8的Tris—HCl缓冲液【将18.15克Tris用水溶解后，用6N的盐酸调至pH8.8，定容到100ml】；
浓缩胶缓冲液【0.5MpH6.8的Tris—HCl缓冲液，将6克Tris溶解后，用6N盐酸调至pH6.8，定容到100ml】；
电极缓冲液【将3克Tris，14.4克甘氨酸和1克SDS，加水溶解后定容到1000ml，pH应为8.3】；
样品缓冲液【将1克SDS，2mlβ-巯基乙醇，5ml甘油，1ml试剂⑹和1.0ml0.1%溴酚蓝，用水溶解并稀释到50ml】； 0.1%溴酚蓝溶液； 已知分子量的标准蛋白； 未知分子量的蛋白质样品；
考马斯亮蓝溶液【称取0.25克考马斯亮蓝R-250，加入45ml乙醇，10ml冰乙酸和45ml水过滤后使用】；
脱色液【37.5ml冰乙酸，25ml乙醇加水到500ml】； 蛋白溶解液； 上样缓冲液；
标准蛋白液（Marker）【用0.15mol/L NaCl配制1mg/mL牛血清白蛋白溶液】
3.3.器材：
台式离心机，电子天平，电泳槽； 电热恒温培养箱； 恒温水浴锅；
电泳槽、移液管、吸耳球、 研钵、培养皿、 微量注射器，TIP。
4.试验步骤：
【制备样品】
称取4粒绿豆，加入石英砂，研钵研磨，加入上样缓冲液，离心（15000rpm共25min）取等体积上清液，加蛋白溶解液，搅拌，臵冰箱30min离心（15000rpm共30min）留上清液。加等体积上样缓冲液 沸水浴3min 加一滴溴酚蓝，取1ml待用。
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【做胶板】
将玻璃板洗净去污，干燥，插槽（内高外低），双手均匀用力，压实，注分离胶至红线，加水层，等到凝固后倒出水层，吸干，注入浓缩胶，插梳子待凝胶后拔梳子，去掉密封条，板子方向掉个（内低外高）。 【制胶液】
SDS—不连续体系凝胶配制
表2-1
试剂名称 分离胶贮液 分离胶缓冲液 浓缩胶缓冲液 10%SDS 1%TEMED 蒸馏水 10%AP 【点样】
浓缩胶 1.5ml - 3ml 0.1ml 18μl 5.3ml 0.1ml 分离胶 8.5ml 2.5ml - 0.2 15μl 8.6ml 0.13ml 用微量注射器加样品和Marker各20μl至样品槽（Marker与样品间隔一个样品槽）。 【电泳】：
在两块板内外层分别加电极缓冲液（内至矮板，外过底线）盖通电（15mA/槽），待溴酚蓝跑到分离胶时，加大电流值（25 mA/槽），至溴酚蓝跑到底边。 【染色】
取出板胶，加水浸洗，开启胶板，除浓缩胶至界面，加染色剂考马斯亮蓝R-250，臵恒温箱2-4h。 【染色】
回收染液，自来水清洗，脱色液脱色（３０h左右），清晰区带。
５实验数据及其处理
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图2-1
相对迁移率（Rm）=蛋白质移动的距离/指示剂移动距离 标准蛋白的相对分子质量和移动距离：
表2-2
标准蛋白 相对分子质量移动距离（cm） 相对迁移率 的对数 4.99 4.82 4.63 4.49 1 1.6 2.8 4.2 0.22 0.35 0.61 0.91 兔磷碱化酶 牛血清蛋白 兔肌动蛋白 牛硫酸酐酶 10